TIMs，TAMs和PS抗体的癌症靶向药物研发进展
Michele Peyrone在1845年描述了一种具有抗癌活性的分子叫做“Peyrone盐”，Alfred Werner在1893年推断出盐的结构，Barnett Rosenberg在1965年发现了这种盐的生物效应，这种物质现在被肿瘤学界称为顺铂。自1965年以来，化疗的设计和应用取得了跨越式的进步，但癌症系统治疗的障碍仍然存在。意识到免疫系统可以用来对抗病人自身的疾病，这为癌症治疗提供了新的策略。免疫治疗现在是一些癌症的一线治疗方法，免疫治疗的选择已经大大增加，包括疫苗、免疫检查点阻断、免疫激动剂和嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗。为了扩大免疫治疗的影响，促使肿瘤逃避免疫监视的信号通路正在进行深入的研究。磷脂酰丝氨酸（PS）是一种存在于所有哺乳动物细胞中的阴离子磷脂，在过去的二十年中，作为一种重要的免疫抑制特性分子，肿瘤利用它来逃避自身的免疫系统。
脂质双层包裹真核细胞和细胞器，将细胞细分为不同的工作区。磷脂双层膜几乎占哺乳动物细胞含量的四分之三。细胞中主要的磷脂包括磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），它们分别占细胞内磷脂的45-50%和30-40%。其他磷脂含量较少，但对膜功能和体内平衡不可或缺的是磷脂酰肌醇（PI）、PS和磷脂酸（PA）。PS是真核细胞中的一个次要成分，PS诱导的过程具有高度的保守性和重要的生理功能。
在一个高度保守的ATP依赖过程中，PS不对称地分布在质膜的内层小叶。PS在某些细胞环境或生理过程中重新分布或翻转到质膜的外叶，其中最为详细的描述是凋亡。凋亡过程中PS的重新分布由floppase和scamblases促成。TMEM16F是一种钙依赖性膜相关磷脂酰化酶，可将PS转运至质膜外叶。然而，在凋亡细胞中暴露PS并不需要TMEM16F。XKR8是一种半胱氨酸蛋白酶3/7激活的磷脂酰化酶，它似乎是导致细胞凋亡而导致PS暴露的原因。其他scramblases，TMEM16和XKR家族的成员也存在，并且可能以组织选择性的方式和/或作为易位PS的替代scramblases发挥作用。离子（Ca2+、K+、Na+）通道中的扰动、细胞应激或线粒体引发的凋亡产生活性氧（ROS）以及DNA损伤、辐射损伤和金属毒性引起的caspase激活可导致细胞凋亡诱导和膜磷脂不对称性崩溃。当PS被重新分配到细胞表面后，它可以作为一个“吃我”的信号来启动细胞清除。除了对凋亡小体的外化作用外，也有报道称PS作用于其他细胞类型，如免疫细胞和癌细胞。例如，在髓源性抑制细胞（MDSCs）、单核细胞、巨噬细胞、活性B细胞、树突状细胞（DC）激活的肥大细胞和T细胞上发现了PS。在肿瘤微环境（TME）中，在肿瘤细胞、分泌微泡和肿瘤内皮细胞上也可以发现暴露的PS。PS介导的细胞清除启动是一个高度保守的过程，它通过PSRs信号阻止局部和全身免疫激活。重要的是，免疫细胞上的PSR激活创造了一个免疫抑制环境，肿瘤细胞将其用作免疫伪装。免疫细胞包括MDSCs、CD4+和CD8+T细胞、DC、巨噬细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NKs）都表达PSR。
PSR分为两个不同的家族：直接结合PS的家族和通过桥接蛋白结合PS的家族。作为直接与PS结合的PSR以T细胞/跨膜、免疫球蛋白和粘蛋白（TIM）受体家族为例，其特征在于其受PS结合驱动的免疫调节活性。作为间接PS结合物的PSR以Tyro3、AXL和MerTK（TAM）受体酪氨酸激酶（RTK）家族为例，该家族使用γ-羧化生长抑制特异性6（Gas6）和蛋白质S（ProS）作为连接受体与PS的桥接分子。TAM受体也被认为是PS诱导激活后的免疫调节活性。鉴于PS介导的信号可以诱导局部免疫抑制，并且肿瘤利用这种进化上保守的途径来逃避免疫检测，因此有理由认为干扰PSR活性可以增强抗癌免疫治疗。多种干扰PSR活性的策略已经被开发出来，包括针对PS的单克隆抗体。
在人类中有三种基因组成了TIM家族：TIM-1、-3和-4。TIM基因编码1型跨膜蛋白，TIM受体由4个明确的区域组成：可变免疫球蛋白结构域（IgV）、粘蛋白结构域、跨膜区和胞内区。所有3种TIM受体都被认为是PSR；然而，抑制性TIM-3单克隆抗体首先进入临床，目前还没有TIM-1或TIM-4单抗的临床试验，尽管针对这些受体的抗体偶联药物（ADC）正在开发中。
TIM-3在多种类型的癌症中表达，包括肉瘤、宫颈癌和胃癌、骨髓瘤、黑色素瘤和肺癌，TIM-3的表达与预后差相关。TIM-3在不同的免疫细胞中也有表达。例如，DC细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞（Tregs）和NK细胞。此外，M2样巨噬细胞比M1样巨噬细胞表现出更高水平的TIM-3表达。与人类表达数据一致，在小鼠肝细胞癌模型中，TIM-3在外周血单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞上的表达与疾病进展相关。有趣的是，PS是已知的唯一与TIM受体家族结合的非蛋白分子。值得注意的是，除了PS，TIM-3已被证实与其他几种参与免疫调节的蛋白质相互作用，包括galectin-9（gal-9）、癌胚抗原细胞粘附分子1（CEACAM-1）和HMGB-1。
表达TIM-3的免疫细胞能促进肿瘤的免疫耐受，因此针对TIM-3的治疗性单克隆抗体已经开发出来并在临床和临床上进行了测试。多种动物模型的研究表明，抗体介导的TIM-3抑制增强了免疫检查点阻断的活性。黑色素瘤患者的高水平TIM-3与耗尽的CD8+T细胞相关，抗TIM-3单抗治疗逆转了这种表型。非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CD4+和CD8+T细胞上的TIM-3高表达。在头颈癌、肾细胞癌、胃癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌和肝细胞癌的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中也发现了TIM-3。此外，TIM-3的表达被认为是T细胞衰竭的标志。最近的一项研究表明，TIM-3+TILs共表达程序性细胞死亡蛋白1（PD-1），但缺乏白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素γ（IFNy）的表达。这引发了人们的猜测，将抗TIM-3与抗PD-1联合治疗可能是克服患者T细胞衰竭并促进免疫检查点阻断反应的可行选择。此外，TIM-3抑制被认为是一种可能的策略，用于启动对其他疗法的反应，如Toll样受体（TLR）激动剂，以促进积极的抗肿瘤免疫反应。例如，阻断TIM-3，然后进行TLR激动剂治疗，导致丙型肝炎单核细胞中IL-12、IL-10和IL-6的表达，这种策略可能适用于癌症。
针对TIM-3的抗体正在多个临床试验中进行研究。NCT03680508是一个II期试验，在肝细胞癌患者中测试抗TIM-3单抗TSR-022和抗PD-1单抗TSR-042。早期数据表明，阻断TIM-3可增强细胞毒性T细胞介导的肿瘤溶解。NCT02608268正在研究抗TIM-3在晚期恶性肿瘤中的作用。这项I/II期试验正在评估抗TIM-3单克隆抗体作为单一试剂并与PDR001（抗PD-1抗体）结合使用。
TAM受体参与肿瘤的发展、生长和转移。两种最具特征的TAM配体是维生素K依赖蛋白Gas6和ProS。Gas6和ProS通过γ羧化基序结合PS，由多种细胞类型产生，包括肿瘤细胞、免疫细胞和TME中的成纤维细胞。通过免疫吞噬细胞表达的TAM受体参与细胞清除，可以诱导耐受性免疫细胞表型。例如，在巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、T细胞上发现了TAM受体，并可间接影响TME中的T细胞功能。Axl和MerTK在骨髓源性树突状细胞中表达，并且Gas6已被证明介导TLR反应的降低，可以通过TLR激动剂刺激后IL-6、肿瘤坏死因子α（TNFα）和I型干扰素的产生来衡量。此外，巨噬细胞和DC上的Axl激活可导致负TLR和细胞因子调节因子、细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）和细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）的上调，从而进一步抑制免疫激活。小鼠模型显示，缺乏TAM受体的表达或TAM信号的抑制会增加肿瘤细胞的免疫介导排斥反应。此外，TAM受体通过与Gas6或ProS结合的PS阻止抗原呈递细胞的激活来阻止免疫反应的诱导。TAM受体Axl和MerTK在许多肿瘤类型中的肿瘤细胞中表达。在肿瘤细胞上激活Axl/MerTK可诱导和维持间充质样肿瘤细胞表型。
因此，TAM受体可以驱动上皮重塑或上皮间质转换（EMT）。EMT与多种肿瘤类型的肿瘤细胞存活、耐药、转移和免疫抑制有关。多种抑制TAM受体的策略已经被开发出来。这些包括中和单克隆抗体，ADC和小分子抑制剂。
Demarest等人发表了一项针对黑色素瘤细胞系中Tyro3的一系列单克隆抗体的有力研究。他们鉴定出了对Tyro3的胞外结构域具有中等到高度亲和力的单克隆抗体，以及在阻断Gas6与受体结合以及抑制配体诱导的酪氨酸信号传导方面的一系列活性。Chien等人构建了一种人抗Tyro3单抗，并报道了这种单抗可以抑制人结肠癌细胞和NIH3T3成纤维细胞的细胞迁移和侵袭。他们还提供了证据，抑制Tyro3可以逆转EMT，提高癌细胞对化疗的敏感性。这些发现和其他多个研究强调了酪氨酸对肿瘤微环境的贡献。迄今为止，Tyro3特异性单克隆抗体尚未进入临床试验阶段。
与Tyro3相反，许多研究小组已经开发出了针对Axl的单克隆抗体。对Axl单克隆抗体DAXL-88的多个临床前研究表明，它可以在体外抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，DAXL-88在携带MDA-MB-231异种移植物的小鼠中显示出令人印象深刻的抗肿瘤功效。BA3011是另一种Axl靶向单克隆抗体，选择性地与人类Axl结合。BA3011在肺癌、前列腺癌和胰腺癌异种移植模型中显示出效果，并已被开发为ADC（CAB-AXL-ADC)。CAB-AXL-ADC已进入临床试验（NCT0342527）。其他治疗性抗Axl单克隆抗体在临床前癌症模型中显示出药效，包括YW327.6S2和20G7-D9。YW是一种噬菌体筛选的单克隆抗体，在非小细胞肺癌和乳腺癌模型的临床前模型中显示出抗肿瘤功效。YW识别小鼠和人Axl，以剂量依赖性介导的方式抑制Gas6与Axl的结合，并下调Axl受体的表达。在异种移植模型研究中，YW降低了血管密度并抑制了肿瘤相关巨噬细胞的炎性细胞因子的表达。YW还增强了厄洛替尼抑制非小细胞肺癌移植物表皮生长因子受体的效果，并减少了转移。YW的临床研究可能包括联合抗血管内皮生长因子（VEGF）策略。20G7-D9也在多种乳腺癌模型中进行了评估，包括异种移植和患者来源的异种移植。20G7-D9以肿瘤细胞Axl依赖的方式抑制肿瘤生长和骨转移病灶，突出肿瘤细胞Axl表达对肿瘤进展的重要性以及Axl靶向药物的疗效。此外，20G7-D9诱导Axl降解，抑制Gas6依赖的细胞信号传导、细胞迁移和EMT。20G7-D9正在作为单克隆抗体和ADC药物同时开发。Axl单克隆抗体目前正在临床前研究中结合免疫治疗在多个适应症中进行评估。
MerTK特异性抗体也已开发出来，并在临床前癌症模型中进行了测试。RGX-019是一种以MerTK为靶点的单克隆抗体，可阻止Gas6诱导的AKT磷酸化，从而抑制黑色素瘤细胞生长和集落形成。此外，同样的研究表明RGX-019在体内可以阻止MDA-MB-231乳腺肿瘤的生长。Cummings等人报道了另一种以MerTK为靶点的单克隆抗体Mer590在体外降低了NSCLC细胞系中的MerTK水平。Mer590抑制STAT6、AKT和ERK1/2的激活，导致MerTK下调，导致细胞凋亡增加和集落形成减少。
目前，还没有针对TAM受体的单抗的临床试验；但是，预计多个TAM单克隆抗体将很快进入临床阶段。TAM受体在肿瘤的免疫抑制信号转导中具有明确的功能，靶向TAM的单抗很可能将在肿瘤患者免疫检查点阻断的背景下进行评估。
Philip Thorpe的实验室开发的PS单克隆抗体特异性地针对肿瘤血管系统。对血管细胞粘附分子1（VCAM1）特异性凝血诱导血管靶向剂（VTA）在荷瘤小鼠体内的疗效进行的研究表明，PS外显于肿瘤内皮细胞而非正常组织的内皮细胞。这导致了一系列以PS为靶点的单克隆抗体的开发。与其他PS结合剂（包括annexin V）不同，单克隆抗体以非钙依赖性的方式结合PS。小鼠体内定位研究表明，靶向PS的单克隆抗体和annexin V特异性定位于肿瘤血管系统，但未出现在正常器官。这些观察结果表明，以阴离子脂质为靶点，如PS，是可行的，并且有潜在的抗癌作用。
Thorpe实验室开发的大多数PS靶向单克隆抗体通过血清辅助因子β2糖蛋白1（β2GP1）与PS结合。β2GP1是一种已知的PS相互作用蛋白，在其天然状态下，β2GP1呈环状蛋白质构象。研究表明，β2GP1在选择抗体和其他激活蛋白/脂质的存在下采用开放的“J形”结构。靶向单抗的PS，包括3G4及其衍生物，结合并二聚β2GP1，使得复合物中每个β2GP1的结构域5与质膜上的PS具有高亲和力结合。
最初开发用于选择性结合肿瘤血管系统的PS靶向单克隆抗体被发现在临床前肿瘤模型中具有抗肿瘤功效。事实上，在多个小鼠肿瘤模型中，单抗已被证明可以提高标准化疗和放疗的疗效。β2GP1是与抗磷脂综合征（anti-phospholipid syndrome，一种自身免疫性疾病）相关的主要抗原，其特征是产生抗磷脂抗体，增加妊娠期血栓形成和并发症，并与系统性红斑狼疮有关。Mineo等人发现Thorpe PS靶向单克隆抗体（1N11）可预防临床前模型中抗磷脂抗体诱导的发病机制。这些数据表明，并不是所有结合β2GP1的抗体都是相同的，同时也强调了1N11或其他治疗性抗PS靶向单抗可能对APS的治疗有用。
对PS靶向单克隆抗体的抗癌作用机制的研究表明，在人原位异种乳腺移植物中，40%的血管被单抗结合。此外，单克隆抗体似乎诱导了针对内皮细胞的抗体依赖性细胞毒性（ADCC），这种效应在化疗的存在下被放大。这些结果表明，化疗诱导PS外化增加，而PS靶向单克隆抗体改变免疫细胞表型，因为TME中的巨噬细胞通常不能执行ADCC。支持PS靶向治疗可改变免疫细胞表型的证据包括观察到肿瘤血管系统在用PS靶向单抗+多西紫杉醇治疗后减少，这对应于单用或联合多西他赛治疗的肿瘤中巨噬细胞浸润分别增加了4倍和14倍。PS靶向还增强了PRIMA-1（APR-246）的疗效，PRIMA-1是一种能激活突变型p53的治疗药物。此外，当与肿瘤腺病毒Delta-24-RGD结合时，PS靶向显示出类似的抗肿瘤效果，该病毒在肿瘤中复制，并在病毒感染后促进高PS暴露。
Yin等人发现靶向单克隆抗体的PS使巨噬细胞的表型从M2样显著改变为M1样表型，并且单克隆抗体诱导MDSC分化为M1样巨噬细胞和成熟的树突状细胞，并减少免疫抑制细胞类型（包括TME中的MDSCs和Tregs）的扩张。另外，通过电子显微镜证实，以PS为靶点的单克隆抗体通过细胞外囊泡与免疫细胞相互作用，并有其它证据证明这种免疫重编程依赖于PS靶向单抗的Fc部分，这表明免疫细胞表型的改变依赖于阻断PS-PSR相互作用和Fc受体与免疫细胞的结合两方面。定向诱导免疫应答的一个关键就是诱导DC的适应性反应。
He等人首次证明了以单克隆抗体为靶点的PS能够促进适应性免疫反应。研究者发现，辐射联合PS靶向单抗可诱导移植原位F98胶质瘤细胞的大鼠长期存活。此外，这些长期存活动物的脾细胞在体外对F98肿瘤细胞具有细胞毒性作用。目前已在免疫活性小鼠的乳腺癌和黑色素瘤肿瘤模型中评估了PS靶向单克隆抗体与免疫检查点阻断（抗CTLA-4或抗PD-1）的组合。例如，Freimark等人表明PS靶向增强了抗PD-1的疗效，并通过增加T细胞的浸润、增殖和活化改变了肿瘤的免疫状况。综上所述，这些数据有力地表明，PS靶向单抗的抗癌效果来自于靶向肿瘤血管系统和通过干扰PS介导的免疫抑制来改变肿瘤的免疫微环境。
Bavituximab，一种以PS为靶点的嵌合单克隆抗体已经在多个临床试验中进行了评估，发现其安全性且耐受性良好。在1期试验的研究中，除了在给予最高剂量的情况下，部分激活的凝血活素在体外测定时间上有些许延长外，Bavituximab耐受性良好，其最大耐受剂量尚未达到。3期试验（SUNRISE，NCT01999673）评价了多西他赛与多西他赛+Bavituximab作为非小细胞肺癌的二线治疗的比较表明，在进展过程中加入PD-1抑制剂Bavituximab+多西他赛比单用多西他赛治疗的患者更有效。此外，对循环中细胞因子的分析表明，低预处理血清中IFNγ水平与联合Bavituximab和免疫治疗的疗效提高有关。提示PS靶向单抗可增加启动T细胞，PS靶向单抗+免疫检查点阻断的联合应用有待进一步研究。下表列出了正在进行的Bavituximab的临床试验。
PS是肿瘤免疫微环境的重要调节因子。PS介导的免疫抑制是一种进化保守的途径，肿瘤通过它来逃避免疫监视。这是由PS与PSR相互作用驱动的，PSR在免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞上表达。通过直接靶向PSR或靶向PS抑制PSR信号传导目前正在临床前和临床试验中进行研究。
尽管PS靶向技术已经在多个适应症的临床试验中取得了进展，但仍有一些问题没有得到解答。PS靶向单克隆抗体的作用机制尚未完全阐明。此外，还不清楚以单克隆抗体为靶点的PS是否干扰所有PSR信号或PSR的一个子集。此外，PS靶向单克隆抗体对肿瘤细胞表型的影响还未被探讨。靶向PS的抗体治疗之路依然任重而道远。
参考文献：