抗体药物的发展历程（4）-抗体的筛选技术

近年来，生物药的市场需求逐年扩容，其中抗体药物因其靶向性好，治疗效果显著，在生物药中占据着举足轻重的地位，目前已经进入了抗体药物发展的黄金时代。随着抗体药的需求越来越大，抗体筛选技术的发展也是日新月异，目前应用较普遍的有杂交瘤技术、抗体文库筛选技术、B细胞克隆技术和转基因小鼠抗体筛选技术。

杂交瘤技术

杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术，是在体细胞融合的技术基础上发展而来的。这项技术将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，利用杂交瘤细胞可以大量的生产单克隆抗体。

1975年，Kohler和Milstein在剑桥大学医学委员会分子生物学实验室，成功把免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成了B细胞-骨髓瘤杂合体。这种细胞杂合体既能在体外培养中无限地快速增殖且存活，又能分泌抗羊红细胞的单克隆抗体。同年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为（Continuous culturesoff  used cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文，正式提出了杂交瘤这一概念。1984年，因其对免疫学做出的贡献，他们与Niels K. Jerne共同荣获诺贝尔生理学和医学奖。

细胞融合技术是杂交瘤技术的基础，通过聚乙二醇（PEG）（最常用）、仙台病毒、电转等方法对细胞进行人工诱导，可使两个细胞通过膜融合形成单个细胞。融合细胞的筛选 HAT培养基筛选技术是杂交瘤技术中另一个关键的技术，在B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，会产生多种融合结果（未融合的骨髓瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、B淋巴细胞自身融合细胞、骨髓瘤细胞自身融合细胞、正确融合的杂交瘤细胞），为了得到所需的杂交瘤细胞，必须利用 HAT 培养基对融合后的细胞进行筛选。HAT培养基的筛选原理为：DNA合成途径有生物合成途径与应急合成途径两种，HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质，氨基喋呤可以对 DNA的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在 HAT培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于 HAT 培养基中培养，其他的融合结果会全部死亡，最终筛选出杂交瘤细胞。

噬菌体展示技术

1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。其因在噬菌体展示相关研究方面的贡献在2018年获得了诺贝尔化学奖。

1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为10⁶的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。而SirGregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

除了噬菌体展示技术之外，基于文库展示的技术还包括：酵母展示技术、核糖体展示技术以及细胞展示技术等。

B细胞克隆技术

通过经典免疫学的研究，我们已经了解，人和动物接受了外源性免疫原（如细菌、病毒、非同源蛋白等）的刺激后，获得性免疫（Adaptive Immunity）被激活，并在 T 淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的协同作用下，由 B 淋巴细胞产生针对于该病原体（或免疫原）的抗体分子；B 淋巴细胞经过一系列的成熟和分化之后，最终形成浆细胞（Plasma cell）将大量的 IgG 分泌到血液等循环系统中；而特定的某一个 B 淋巴细胞在经历了 V-D-J 重排、Class Switch 和 Somatic maturation 之后，只含有一对编码 IgG 重链和轻链的基因。因此，经过 B 淋巴细胞表面标记物和抗原特异性筛选，可以获得针对特异性抗原的单个 B 淋巴细胞，然后通过分子生物学手段从中获得编码抗体 IgG 的重链和轻链基因，并在体外重组表达验证，是目前获得单克隆抗体最有效和快速的技术。

基于单 B 细胞筛选的抗体发现技术发展，还得益于流式细胞技术、微流控技术（Microfluidic）以及光流体技术（Optofluidic）等相关生物技术的发展和成熟，使其成功的从实验室走向商业化应用，并在单克隆抗体特别是治疗性单克隆抗体的开发方面被广泛应用。

基于单 B 细胞分选技术的单克隆抗体开发平台，和传统的单克隆抗体开发平台相比，最突出的优势在于能够从人体内直接筛选获得全人源单克隆抗体；同时，也能够大大缩短研发周期，从获得康复病人的外周血淋巴细胞开始，一般来说在 4-6 周内即可获得全人源单克隆抗体，并完成相应的生物学功能实验（如病毒结合和中和实验、ADCC 实验等）；并且由于所获得是全人源单克隆抗体，可以大大简化甚至于不需要抗体人源化改造工程，快速推进至临床试验。　　

转基因小鼠全人源抗体筛选技术

早在1985年，Alt等人就曾提出可以应用转基因技术得到具有人源序列的单克隆抗体。1989年，Bruggemann等人在小鼠中表达了人源重链，从而产生了转基因编码的免疫应答。而在1994年，Lonberg和Jakobovits的团队分别采用了不同的方法构建了能够表达人源抗体的转基因小鼠。Lonberg利用了核内显微注射的方法，而Jakovovits用的是酵母人工染色体（YAC）的方法。重链包含3个重链可变区（VH），16个D，所有的6个JH区。

Abgenix的XenoMouse®是第一个同时有大部分人源VH和人源Vκrepertoire的转基因小鼠品系。这些XenoMouse®小鼠有百万碱基对大小的酵母人工染色体，在重链基因座，有34个有功能的VH基因，全部的DH和JH区域，作为Cμ和Cδ功能下游的人源Cγ2基因；κ轻链基因座含有18个Vκ基因，全部五个功能性的Jκ区，和Cκ基因。由于YAC可以整合到小鼠染色体中，这样得到的小鼠具有较好的基因稳定性。2005年，安进以22亿美元收购Abgenix。XenoMouse平台上开发出的第一个单抗药物是Abgenix和安进共同开发的抗EGFR单抗panitumumab（于2006.9被FDA批准），这也是基于转基因小鼠的第一个全人源单抗药物。

另一个用于产生全人源抗体的小鼠是GenPharmInternational, Inc开发的HuMab™或者叫Ultimab®。1997年，Medarex收购了该公司获得这一技术平台。2009年，BMS以24亿美元收购Medarex，将Humab小鼠收入囊中。这一平台可产生高亲和力（纳摩到亚纳摩级别）的人源抗体。Ofatumumab是基于Ultimab平台开发出的抗CD20单抗，它和同为CD20抗体的rituximab靶向的表位不同。Ofatumumab于2009年十月被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病。Ultimab平台还有一系列诸如Canakinumab（抗interleukin-1β的IgG1单抗，用于治疗一种罕见的自身炎症性疾病Cryopyrin蛋白相关周期性综合征）, Ustekinumab（靶向IL-12和IL-23所共有的p40亚单位，用于18岁及以上活动性银屑病关节炎患者的治疗）等单抗产生。