低氧相关分子在骨关节炎发生发展中的作用
作者：陈龙、张一、佘荣峰、李森磊、罗锐、戴涛、王远政
来源：中华创伤骨科杂志, 2019,21(3)
骨关节炎是一种退行性关节疾病，其特征在于关节软骨破坏、软骨下结构损伤及骨重建，最常发生于负重的髋、膝关节。关节软骨损伤导致关节间隙变窄、关节疼痛和功能丧失，严重者甚至需要进行人工关节置换[1,2,3]。流行病学研究表明，膝关节骨关节炎的人群发病率为10.5%，髋关节为8.5%，其中女性多于男性[4]。在我国约1.2亿人患有骨关节炎，其发病率超过了心、脑血管疾病的发病率。骨关节炎的发生、发展与软骨细胞稳态密切相关，当软骨细胞内促进基质降解的反应超过了其合成能力时，软骨细胞合成与分解的动态平衡被打破，最终导致骨关节炎的发生。由于关节软骨缺乏血液供应和关节腔相对密闭，所以关节软骨组织本身是一个低氧环境，其氧含量为1%~5%，且从软骨表面到深层区域氧含量逐渐减少[5]。故生理条件下，软骨细胞生存于相对缺氧的环境中，为了适应这种环境，软骨细胞产生了一系列低氧相关分子。低氧相关分子参与调控软骨细胞的合成与分解动态平衡、自噬以及凋亡过程，进而影响骨关节炎的发生、发展。本文旨在回顾近年来发表的相关文献，探讨低氧相关分子在骨关节炎发生、发展中的作用，以期为今后基础和临床研究提供新的思路。
HIF蛋白属于转录因子家族，是细胞应对缺氧反应的关键调节因子，由α和β亚基组成。目前发现的人类HIF蛋白家族主要包括HIF-1、HIF-2和HIF-3 3种。常氧条件下，HIF蛋白α亚基上的脯氨酸和天冬酰胺被脯氨酰羟化酶羟基化，脯氨酸的羟基化激活了冯希佩尔-林道蛋白（Von Hippel-Lindau protein, pVHL）介导的泛素化作用，最终导致HIF-α降解；低氧条件下，HIF-α不被羟基化，而与β亚基异二聚体化，入细胞核激活靶向基因，产生生物学作用[6]（图1）。目前研究表明，HIF-1α对维持关节软骨基质的动态平衡起着重要的保护作用，HIF-2α则对关节软骨基质有负向分解作用，HIF-3α主要是作为HIF-1α和HIF-2α的负调节因子[7]。
图1 HIF传导通路对骨关节炎的影响，HIF为缺氧诱导因子，PHD为脯氨酰羟化酶，pVHL为冯希佩尔-林道蛋白，SOX9为HMG盒超家族成员-9，IL-6为白细胞介素-6，MMP为基质金属蛋白酶
一、HIF-1α
HIF-1α是细胞应对低氧反应的主要转录调节因子，可同时存在于人正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中[8]。目前已证实HIF-1α可表达于人胎儿软骨细胞中，且广泛分布于早期分化阶段的软骨细胞中，尤其在去分化的软骨细胞中有高表达，并通过调控HMG盒超家族成员-9（Sry related HMG box-9, SOX9）的表达来调节成软骨作用，这些研究结果提示HIF-1α在软骨组织发育和维持过程中扮演着重要角色[7,9]。关节软骨组织是一个无血管的组织，其营养和氧气主要靠关节滑液和软骨下骨的扩散作用供给，所以正常的关节软骨是一个低氧组织[10]。软骨细胞正是处于这样一个低氧环境中，而作为应对低氧反应的主要转录调节因子，HIF-1α可通过诱导编码各种蛋白基因的表达来维持软骨细胞的分解和合成代谢平衡[11]。
HIF-1α可从多方面影响软骨细胞以应对低氧反应。HIF-1α可通过调节Wnt信号传导通路，限制基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase, MMP）-13的表达来抑制软骨细胞的分解代谢[12]。相关研究已证实，敲除HIF-1α基因的小鼠，其MMP-13表达增加，软骨的退化和破坏程度增加[13]。HIF-1α还可以调控胶原（增加Ⅱ型胶原蛋白α1链表达，抑制Ⅰ型胶原蛋白α1链、Ⅰ型胶原蛋白α2链和Ⅲ型胶原蛋白α1链表达）和蛋白聚糖表达，通过增加软骨细胞外基质的合成使软骨细胞保持其生理功能[14]。除此以外，HIF-1α还通过调控软骨细胞的能量代谢来适应低氧环境。敲除HIF-1α的软骨细胞不能保持细胞内所需的ATP水平，且HIF-1α靶向激活的血管内皮生长因子和蛋白多糖表达量也随之减少；在低氧环境中，HIF-1α还抑制一系列蛋白多糖的合成，以降低能量密集型活动[15]。在骨关节炎的病理进程中，HIF-1α可通过调控骨关节炎软骨新陈代谢过程的关键因子微体前列腺素E合成酶-1来影响骨关节炎的病程进展。不仅如此，HIF-1α还通过调控软骨细胞的凋亡来保护关节软骨[16]。在敲除HIF-1α的软骨细胞中，无论是在常氧还是低氧条件下，其细胞凋亡的比例都有增加，敲除HIF-1α的小鼠动物实验也观察到软骨类组织中大量细胞死亡[17]。反之，如果增加HIF-1α的表达或者抑制其降解，可使得其细胞外基质表达增加，这一过程可阻止软骨细胞凋亡过程的发生[18]。临床研究表明，HIF-1α在血清和关节滑液中的表达量与影像学膝关节骨关节炎的严重程度相关，其在未来可作为一个预测骨关节炎发生、发展的生物学指标[19]（图1）。
综上所述，HIF-1α作为软骨细胞在低氧环境下的保护因子，可通过调控软骨基质合成和分解、抑制相关炎症因子表达、调节软骨细胞能量代谢和凋亡等多个渠道来维持关节软骨的生理动态平衡。
二、HIF-2α
HIF-2α是低氧环境下调控软骨组织分解代谢的重要因子，主要存在于高度分化的软骨细胞中。研究表明，小鼠和人的骨关节炎软骨组织内HIF-2α的含量明显高于正常关节软骨组织[20]。HIF-2α可诱导软骨细胞合成一系列分解代谢关键因子，如MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-12、MMP-13、蛋白聚糖酶-1、蛋白聚糖酶-2、一氧化氮合成酶-2和环氧酶-2[21,22]。此外，HIF-2α还被认为参与了血管早期生成，是软骨内成骨过程中的一个重要代谢元件[23,24,25]。在一个由HIF-2α诱导形成的骨关节炎软骨破坏小鼠动物模型中观察到HIF-2α可直接激活白细胞介素-6基因，调控MMP-3和MMP-13的表达[26]。自噬是软骨细胞生命周期的一个中间步骤，它使得细胞在被凋亡作用淘汰之前分化为一个成熟的表型[27]。细胞自噬不同于细胞凋亡和细胞坏死，可调节软骨细胞适应低氧环境，提高软骨细胞生存能力，可能是阻止或延缓软骨退变的重要机制之一[28]。研究表明应用siRNA技术沉默小鼠肥大软骨细胞中的HIF-2基因后，可观察到细胞中活性氧和HIF-1表达升高，而过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性降低；同时，蛋白激酶B-1和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活性及B淋巴细胞瘤-xL基因表达亦降低，最终诱导了软骨细胞的自噬作用[17]。由此可见，HIF-2α在调控软骨细胞成熟的自噬作用过程中主要起抑制作用，而HIF-1α主要起促进作用。此外，随着HIF-2α在人和小鼠骨关节炎软骨细胞中的表达增加，软骨细胞的凋亡作用也呈现一个增加的趋势；不过单独过表达或敲除HIF-2α都不能直接引起软骨细胞凋亡[29]。HIF-2α对软骨细胞凋亡的影响是通过其直接靶向基因Fas基因来调控的，Fas基因激活下游的相关凋亡关键因子，导致软骨细胞凋亡，最终造成骨关节炎关节软骨破坏[29]（图1）。
敲除HIF-2α的小鼠与对照组相比，其软骨退变减轻，骨赘生成减少，提示HIF-2α是调控骨关节炎发病的关键因子[20]。目前以HIF-2α为目标靶点治疗骨关节炎已经成为研究热点。Zhang等[24]的研究提示软骨调节素-1可以通过抑制HIF-2α介导的分解作用来保持软骨的合成与分解稳态。Pi等[21]使用基因递送的方法，利用纳米粒包裹抗HIF-2α的siRNA抑制HIF-2α的表达，以治疗小鼠骨关节炎关节软骨退化，取得了良好的效果。Cheng等[30]证实骨调素可通过CD44反应抑制HIF-2α的表达，在骨关节炎进程中对软骨细胞起保护作用。由此可见，HIF-2α参与了骨关节炎的病理进程，是关节软骨退变的关键调节因子。Choi和Choi[31]利用红霉素A抑制HIF-2α的表达，可有效缓解骨关节炎软骨的进一步破坏。
与HIF-1α对关节软骨的保护作用不同，HIF-2α通过促进分解代谢相关酶的合成、增加软骨血管化作用和调控软骨细胞自噬与凋亡等手段促进骨关节炎的发生和发展，故HIF-2α在未来可作为治疗骨关节炎的关键靶点之一。
三、HIF-3α
HIF-3α与HIF-1α、HIF-2α在碱性螺旋-环-螺旋-PAS蛋白结构域上大约有55%的氨基酸序列相似，故命名为第3种HIF转录因子。然而到目前为止，我们对HIF-3α在细胞内对低氧反应的调节机制了解得仍较少。HIF-3α与HIF-1α、HIF-2α在蛋白结构和对基因表达的调控上不同。长期以来，因HIF-3α也有转录调节功能而被认为是HIF相关基因的负向调节因子。相关研究还表明其负向表达调控是通过竞争性结合HIF-1α和HIF-2α靶向基因的转录元件来实现的[32]。HIF-3α在软骨领域的研究始于2012年，Schrobback等[33]发现常氧或低氧条件下HIF-3α在软骨细胞内都有表达，但表达量相对较低，且转录功能依赖于低氧环境。Markway等[34]还通过一系列体内、体外实验发现，HIF-3α表达水平的高低可能提示软骨细胞肥大并参与了软骨细胞表型的调控。Li等[35]的研究还表明，敲除HIF-3α后骨关节炎软骨细胞的增殖能力和Ⅰ型胶原α1链的基因表达水平升高，而X型胶原α1链和MMP-13的基因表达水平下降。由于目前关于HIF-3α的研究报道较少，故HIF-3α对骨关节炎软骨退变进程的影响还需进一步研究去发现和证实。
HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α在骨关节炎病理进程中相互关联发挥调控作用，但是相关调控网络还有待于进一步探究。因此，正确认识和了解关节软骨内低氧环境下相关因子的表达，不仅可以对骨关节炎发生、发展的机制进行更进一步的探究，还对今后的临床诊治和药物研发工作起到更好的指导和帮助作用。
目前发现的低氧应答调控机制仍局限于HIF家族。在骨关节炎发生、发展过程中是否存在其他低氧应答调控机制，对进一步描绘低氧环境下骨关节炎的调控网络有着重要意义。NDRG3是N-myc下游调节基因家族成员之一。NDRG3定位于人类染色体20q11.21-11.23，cDNA长度为2 588 bp，含有一个开放阅读框架，相对分子质量为43 kD[36]。NDRG3存在于多种人体器官组织中，如卵巢、前列腺、睾丸、大脑、脊髓、胸腺、心脏及肾脏。研究表明，过表达NDRG3可上调细胞中血管趋化因子-3和血管趋化因子-5的表达，导致血管生成量增加[37]。Lee等[38]发现NDRG3于常氧环境下可被过氧化氢酶-2/pVHL途径降解；低氧环境下，NDRG3与乳酸结合后，可避免被降解，进而与c-Raf蛋白结合，通过调节低氧介导的加速纤维肉瘤-细胞外信号调节激酶通路，促进血管化和细胞生长（图2）。Yao等[39]在体内、体外脑缺血模型实验中证实，低氧环境下let-7f基因可通过调控NDRG3的表达使得局部组织血管化加强和细胞存活增加；let-7f/NDRG3通路可作为缺血性中风潜在的治疗手段。目前关于NDRG3在骨关节炎软骨退变方面的研究极少见文献报道，在我们的一项关于NDRG3与骨关节炎发生、发展研究的预实验中，免疫组织化学染色结果发现骨关节炎关节软骨组织高表达NDRG3（图3），但其具体的分子机制还有待于进一步研究确认。以上介绍了一个新的低氧相关分子（NDRG3）介导低氧反应的分子机制，可以帮助我们更加立体、全面地描绘骨关节炎疾病的发生和发展机制，从而为其临床防治提供新的思路。
图2 常氧与低氧环境下NDRG3的传导通路，NDRG3为N-myc下游调节基因-3，PHD为脯氨酰羟化酶，PVHL为冯希佩尔-林道蛋白，ERK1/2为细胞外调节蛋白激酶1/2
图3 关节软骨NDRG3免疫组织化学染色结果：正常组关节软骨表面光滑平整，NDRG3整体表达呈阴性× 40（A）；正常组透明软骨细胞排列有序×100（B）；正常组软骨细胞内NDRG3表达为阴性× 200（C）；骨关节炎组关节软骨表面极不平整，NDRG3整体表达呈阳性× 40（D）；骨关节炎组纤维软骨细胞增多且排列杂乱× 100（E）；骨关节炎组软骨细胞内NDRG3表达为阳性× 200（F）；NDRG3为N-myc下游调节基因-3
导致骨关节炎关节软骨退变的主要原因为降解酶对细胞外基质的分解反应和凋亡或自噬引起的软骨细胞死亡。由于关节软骨组织是一个低氧环境，故低氧相关分子在骨关节炎的病理进程中起着至关重要的作用。HIF-1α和HIF-2α在骨关节炎软骨组织中表达都有升高。HIF-1α可促进细胞外基质的合成和抑制细胞凋亡，是软骨细胞适应低氧环境的关键因子；HIF-2α诱导软骨细胞合成一系列细胞外基质降解酶，直接影响着骨关节炎的病理进程，未来可作为治疗骨关节炎的关键靶点；而HIF-3α对骨关节炎软骨退变的影响还需要进一步研究。NDRG3介导的低氧反应提示影响细胞低氧应答的信号通路较既往发现的要复杂很多。而在骨关节炎疾病病程中发挥重要低氧应答调控作用的，很可能并不局限于已知的经典调控因子或通路，而是由更多的相互关联或独立的调节通路共同发挥作用。NDRG3介导的低氧反应与骨关节炎的关系亦需未来进一步的研究来证实。
志谢 本研究得到了美国霍普金斯大学Zhiyu He博士的协助
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献：略