泛说前沿第二十三期 | 双等位基因变异的在肿瘤诊断及治疗中的意义

通过对视网膜母细胞瘤病例的统计分析，Knudson提出“二次打击”假说。在遗传性肿瘤中，例如RB1等抑癌基因上发生双等位基因变异，导致肿瘤细胞相关基因性功能缺失，促进肿瘤发生发展。第一次打击通常是抑癌基因的胚系变异，使个体产生遗传易感。第二打击为该基因的体系变异，促进肿瘤发生发展。DNA损伤修复通路基因的双等位基因变异检测在肿瘤诊断及治疗中具有重大价值，这里为大家介绍6篇相关文献。

1. 双等位基因错配修复缺陷综合征——重度林奇综合症的管理和预防

Biallelic mismatch repair deficiency syndrome - management and prevention of a devastating manifestation of Lynch syndrome

Journal: Gastroenterology

IF: 22.682

DOI: 10.1053/j.gastro.2017.03.013

Biallelic mismatch repair deficiency (BMMRD) syndrome （也被称作constitutional MMR deficiency (CMMRD) syndrome）为常染色体阴性遗传病，表现为儿童白血病、淋巴瘤、脑肿瘤(高级别神经胶质瘤、髓母细胞瘤或原始神经外胚层肿瘤)、肠息肉病、小肠和结直肠腺癌。19世纪五十年代，第一例BMMRD被在一个大型的遗传性非息肉性肠癌家族中被报导。带有MLH1突变的成员近亲结婚导致带有双等位基因变异的子代在幼年就表现出了血液恶性肿瘤以及Ⅰ型神经纤维瘤病的症状——café au lait macules 。这篇综述根据MMR相关基因的突变频率，按父母是否进行了lynch综合征诊断以及诊断结果，估计了其后代患BMMRD的风险（如下图一）。

由于BMMRD发生率很低，大多数医生会参照林奇综合征对患者进行管理和治疗。研究者回顾分析的146名BMMRD患者中，发生结肠癌的中位年龄为16岁，结直肠腺瘤发现中位时间为9岁。因此作者建议采用更积极的检测手段及治疗手段。如6岁开始每年一次的肠镜检查，如发现息肉则每半年一次。

图一 按父母的Lynch检测情况估计BMMRD的风险

2. 种系双等位基因Mcm8变异与早发林奇样综合征相关

Germline biallelic Mcm8 variants are associated with early-onset Lynch-like syndrome

Journal: JCI Insight

IF: 8.315

DOI: 10.1172/jci.insight.140698

以DNA错配修复缺陷(dMMR)为特征的林奇综合征是遗传性结直肠癌（CRC）最常见的病因。“林奇样综合征”( Lynch-like syndrome，LLS)患者是指MLH1、MSH2、MSH6、PMS2或EPCAM基因上未发生致病胚系变异且MLH1也未发生体系甲基化修饰，但是肿瘤表现为dMMR的患者。

为了探索LLS的致病机制，该研究的纳入了16名在40岁之前被诊断为LLS的遗传性非息肉性结直肠癌（CRC）患者。所有患者肿瘤均表现为微卫星不稳定（MSI）或IHC检查显示MLH1、MSH2、MSH6或PMS2低表达，但均未检出BRAF V600E突变、MLH1甲基化，以及MMR基因（包含EPCAM基因）胚系致病变异。

研究者们通过对这16名患者的全外显子测序（WES）分析，在一名男性患者中鉴定到2个罕见的能造成MCM8蛋白功能完全缺失的隐性遗传胚系突变（顺式的p.Lys118Glufs*5和p.Ile138Mets）。该男性患者，年龄40岁，左半结肠IIIB期完全分化粘液性腺癌，但是该患者无肿瘤家族史。且肿瘤组织表现出高TMB且有明显的MMR相关突变特征SBS15。

研究者们为了进一步研究MCM8变异的致病性，利用DLD-1 细胞系构建了MCM8 KO细胞系。彗星实验显示，MCM8 KO细胞系有明显的DNA修复障碍且表现为MSI。而在MCM8 KO细胞系中表达MCM8 p.Lys118Glufs*5以及MCM8 p.Ile138Mets无法恢复其DNA修复障碍。本研究揭示了MCM8 双等位基因变异导致LSS的分子机制（如下图二）。

在另一个独立的含有131例的家族性肿瘤队列的公共数据中，研究者们也进行了MCM8及MCM9变异筛选。发现一例患者带有MCM8双等位基因变异的乳腺癌患者以及其家族的5名杂合变异的携带者；两例带有MCM9双等位基因变异的卵巢癌患者以及其家族的12名杂合变异的携带者。这也提示了该发现的临床意义，在LSS诊断时可以考虑MCM8/9的胚系双等位基因变异。

图二 MCM8变异的致病分子机制

3. 利用TCGA数据进行外显子组层面的双等位基因变异鉴定林奇综合征分子特征

Exome-wide analysis of bi-allelic alterations identifies a Lynch phenotype in The Cancer Genome Atlas

Journal: Genome Med

IF:11.117

DOI: 10.1186/s13073-018-0579-5

根据二次打击模型，肿瘤易感胚系变异通常需要再次发生另一个等位基因体系变异才能驱动肿瘤发生。但是胚系变异是否普遍需要结合体系变异形成双等位基因变异才能影响肿瘤分子遗传学特征尚不清楚。比如BRCA1/2的胚系以及体系的双等位基因变异都会引起突变特征SBS3占比升高，但是单一的胚系变异不足以引起这种变化。研究者通过TCGA数据库中的33个癌肿的全外显子测序数据、甲基化基化数据以及SNP芯片数据，比较了带有单等位基因变异以及双等位基因变异肿瘤的分子特征。

在可获得数据的7790例患者中鉴定到95601个胚系功能缺失变异、225257个体系功能缺失变异以及863798个加基化事件。研究者将下列三种情况定义为伴随双等位基因变异的体系变异：1）胚系系变异伴随体系变异（germline:somatic）；2）胚系变异伴随体系的加基化导致的基因沉默（germline:methylation）；3）胚系变异伴随体系杂合性缺失（germline:LOH）。

令人意外的是，研究者发现只有4%的体系变异为双等位基因变异，其中germline:somatic占0.02%，germline:methylation占0.04%，germline:LOH占3.4%。这些双等位基因变异富集于DNA损伤修复通路。而germline:somatic型双等位基因变异富集于错配修复（MMR）通路。

研究者鉴定到10例携带林奇相关MMR基因germline:somatic型双等位基因变异的患者，其中6例的胚系变异是明确功能缺失变异，另4例的胚系变异为错义变异但是功能不明确（如图3）。功能缺失变异的germline:somatic型双等位基因变异的患者平均肿瘤诊断年龄早于14岁，且MSI程度显著高于其他患者2.6倍。功能未明的germline:somatic型双等位基因变异患者，MSI程度略低但仍高于无变异或携带单等位基因变异的患者，但肿瘤诊断年龄与其他组无明显差异。而林奇相关MRR基因的胚系变异在不伴随体系变异的情况下，单等位基因的胚系变异对MSI程度影响不大。同样的现象也能在BRCA以及FA相关基因上看到，单等位基因的胚系变异并不能使肿瘤表现为SBS3占比升高的症状。

图3 带有林奇相关基因变异患者的临床及分子遗传学特征。

值得注意的是24%的MSI-H肿瘤在MMR基因上没有明确的基因组变异（包含胚系变异，体系变异以及甲基化），这说明还有一些未知的机制可能会导致MSI程度升高。为了寻找与MSI升高相关的变异，研究者把筛选范围扩大到所有的DNA损伤修复基因。如图4所示，和既往报导一致，MLH1体系变异、MSH2体系变异、MLH1甲基化都与MSI程度相关，而无明显的胚系变异与MSI程度相关。除此之外，SHPRH甲基化显著减低自身的mRNA表达量并且与MSI程度显著相关，可能是MSI肿瘤的潜在致病原因。

图4 SHPRH加基化与MSI程度相关

4. 同源重组修复基因双等位基因变异的泛癌种分析

Pan-cancer analysis of bi-allelic alterations in homologous recombination DNA repair genes

Journal: Nat Commun

IF:14.919

DOI: 10.1038/s41467-017-00921-w

BRCA1/2是同源重组修复（HR）通路上的重要突变且其胚系突变会导致遗传性乳腺癌及卵巢癌。但是HR通路其他基因的胚系变异、体系变异、单等位基因变异以及双等位基因变异是否也有促进肿瘤发生的作用显著还不清楚。研究者为了这一目的，对TCGA数据库中的全外显子数据及SNP芯片数据进行分析，比较了单等位基因变异与双等位基因变异肿瘤的临床及分子遗传学特征。

在可获得数据的8178例肿瘤样品中，13%的肿瘤样品带有至少一个HR相关基因的恶性变异。POLQ是发生单等位基因变异最多的基因，ATM、BAP1和CDK12等基因也以单等位基因变异为主。BRCA1/2是发生双等位基因变异最多的基因，CHEK2、FANCM、PALB2紧随其后。值得注意的是，最常见的双等位基因变异类型为一个胚性致病变异伴随体系杂合性缺失。

卵巢癌和乳腺癌是HR相关基因双等位基因变异发生频率最高的两个癌肿，分别占到25%以及10%。但是值得注意的是，只有45%的HR基因双等位基因变异发生在传统的的BRCA相关遗传性肿瘤中（包括乳腺癌，卵巢癌和前列腺癌）。HR通路在其他肿瘤发生中的作用缺乏研究。特别值得注意的是，胃癌中HR基因双等位基因变异发生率达到10%左右，且既往研究报导过部分胃癌有明显的HR相关突变特征。

携带HR相关基因恶性双等位基因变异肿瘤样品有明显的同源重组缺陷相关分子特征，比如染色体大片段转易位以及突变特征SBS3占比显著升高。不同基因的双等位基因变异有互斥现象。但是与无HR相关基因变异的肿瘤样品相比，携带功能未知的双等位基因变异以及所有的单等位基因变异的肿瘤样品在HR相关分子特征上无明显差异。不仅如此，携带HR相关基因恶性双等位基因变异的卵巢癌患者明显能在铂类化疗中受益。

图5 HR相关基因恶性双等位基因变异表现出同源重组缺陷分子特征

5. 通过基因组学鉴定同源重组缺陷的胰腺腺癌并指导治疗决策

Genomic methods identify homologous recombination deficiency in pancreas adenocarcinoma and optimize treatment selection

Journal: Clin Cancer Res

IF:12.531

DOI:10.1158/1078-0432.CCR-20-0418

MSK癌症中心收集了411名局部晚期及转移性胰腺腺癌，用于系统性比较带有同源重组缺陷相关基因变异与铂类治疗疗效相关性。BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、BAP1、BARD1、BLM、BRIP1、CHEK2、FAM175A、FANCA、FANCC、NBN、RAD50、RAD51、RAD51C和RTEL1被纳入到分析中，其中BRCA1、BRCA2和PALB2被归为核心同源重组基因。

在262名进行了体系及胚系HR相关基因基因变异的患者中，有50名患者带有变异，其中15%的患者带有胚系变异、4%患者带有体系变异。携带胚系变异及体系变异患者在染色体稳定性以及疗效上没有明显差异，所以后续分析进行了合并分析（如图6）。

图6 带有HR相关基因变异的胰腺外分泌肿瘤的分子遗传学特征

携带HR基因双等位基因变异的肿瘤（占11%）样品以及携带核心HR基因变异的肿瘤样品（占12%）具有更高水平的染色体不稳定性（图7），且在一线铂类化疗的患者中双等位基因变异携带者的PFS更长。但是在非一线治疗的患者中，这种相关性并不存在。

图7 HR基因突变类型与染色体大片段易位程度相关

6. 同源重组缺陷胰腺导管腺癌的基因组特征及分类

Genomic features and classification of homologous recombination deficient pancreatic ductal adenocarcinoma

Journal: Gastroenterology

IF: 22.682

DOI: 10.1053/j.gastro.2021.01.220

化疗是晚期及转移性胰腺导管癌的标准化治疗方式，但是患者的总生存期不到1年。同源重组缺陷是部分胰腺导管癌的分子特征，同时也是化疗以及PARP抑制剂治疗良好预后的标志物。除了BRCA1/2等同源重组相关基因变异以及基于Myriad’s MyChoice HRD 检测的GSI得分（HRDscore）外，突变特征例如SBS3、结构变异负荷以及基于WGS检测的 HRDetect评分也是同源重组缺陷分子特征。研究者们使用WGS（中位测序深度53X）分析了391名患者的上诉4个同源重组缺陷分子特征并进行分组比较。

391名患者中，49名患者携带致病性胚系变异（其中12例BRCA1、27例BRCA2以及4例PALB2），其中43名患者为双等位基因变异。相对于无HR相关基因双等位基因变异肿瘤，双等位基因变异肿瘤表现出明显的SBS3占比升高，大于4个碱基的缺失占小微缺失比例升高、10kb以下的结构变异中缺失占比升高以及1kb-100 kb的结构变异中串联重复比例升高等特征。而6例单等位基因变异肿瘤的分子特征更倾向于无HR相关基因双等位基因变异肿瘤的特征。

研究者使用基于WGS检测的HRDetect、SBS3以及 MyChoice HRD assay使用的的GSI对BRCA双等位基因变异进行分类，灵敏度分别为98%、95%以及91%，特异性分别为100%、100%、83%。因此根据HRD分子特征，研究者们将胰腺导管腺癌分为有HRD分子特征的BRCA1失活型、BRCA2失活型、PALB2失活型、RAD51家族基因变异型，以及无BRCA变异但串联重复占比高的non-BRCA TDP型。无明显HRD分子特征的肿瘤分为携带BRCA1/2变异但是为单等位基因变异的monoallelic型以及无明显HRD相关分子特征的typical型。值得注意的是有6例患者带有ATM的功能缺失性胚系变异患者（其中2例伴随体系杂合性缺失为双等位基因变异）以及2例患者带有CHEK2的功能缺失性胚系变异都被归入typical型。

图8 根据同源重组分子遗传学特征将胰腺胆管腺癌分为7类

391名患者中有188名患者进行了手术切除，203名患者为晚期胰腺导管癌。203名晚期患者中又有182名被纳入到COMPASS实验中，接受了化疗并且使用RECIST进行响应评价。研究者们用上诉HRD分子特征进行分组，分析了患者预后。手术治疗患者中，仅有BRCA1/2及PALB2失活型患者相比其他类型肿瘤患者有更长得生存期，但是考虑到患者年龄及肿瘤分期后差异不显著。但是将患者划分为铂类化疗治疗及非治疗组后，结果显示HRD型（包括GSI，SBS3以及HRDetect评分较高组）以及BRCA1/2和PALB2致病携带胚系变异的患者都能从铂类化疗中收益。在182名被纳入到COMPASS实验中的患者中，使用BRCA1/2和PALB2致病胚系变异、HRDetect、SBS3以及GSI进行分组都可以显著富集铂类化疗响应患者（如图9）。

图9 多个同源重组分子遗传学特征都能响应富集铂类化疗的患者

总结：

同源重组修复及错配修复相关基因的单等位基因变异无法导致肿瘤具有DNA损伤修复缺陷的分子特征。携带同源重组修复双等位基因变异的胰腺癌患者的化疗疗效优于携带单等位基因变异的患者。

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