小麦抗白粉病基因Pm8和Pm17
1. Pm8和Pm17基因的克隆
抗白粉病基因Pm3和Pm8分别位于1AS和1RS染色体末端，鉴于麦类作物的基因在染色体上具有较为保守的顺序，Hurni等(2013)提出Pm8可能是Pm3直系同源基因的设想。白粉病抗性鉴定结果显示，对Pm8无毒的35个菌株对一些Pm3等位基因也无毒，而对Pm3等位基因有毒的13个菌株对Pm8也都有毒，可见Pm8和Pm3可能具有相似的功能，能识别类似的病原效应蛋白。这为利用Pm3基因序列克隆Pm8提供了依据。利用Pm3启动子区184-bp的DNA片段作为探针进行Southern杂交，在多个1BL.1RS易位系和黑麦中都检测到特异性条带，说明1RS上存在Pm3同源基因(图1)。
图1 Pm3同源基因在黑麦和1BL.1RS易位系中的检测(Hurni et al., 2013)
图2 Pm8基因的遗传和物理(Hurni et al., 2013)
Hurni等(2013)采用基因枪介导的小麦叶片单细胞瞬时表达技术对克隆到的候选基因进行了功能验证。在小麦品种Federation和Chancellor叶片中瞬时表达候选基因后，用Pm8无毒菌株07230接种，吸器指数(haustorium index)分别为27%和26%，而空载体对照的吸器指数分别为66%和67%。而当用Pm8毒性菌株07250接种时，候选基因的吸器指数与对照组无显著差异。该结果表明所克隆的Pm3同源基因具有抗白粉病功能。进而将候选基因构建到玉米泛素启动子(ubi)下游，转化感病小麦品种Bobwhite，转基因株系对无毒菌株07230表现为抗病，而对毒性菌株07250表现为感病(图3)。从而证实所克隆到的Pm3同源基因就是Pm8。
图3 Pm8基因的功能验证(Hurni et al., 2013)
Pm17基因是另一个来源于黑麦(Insave)1RS染色体上的抗白粉病基因，起初以1AL.1RS的形式转入小麦品种，后通过与携带Pm8基因的1BL.1RS易位系杂交，将小麦品种Amigo中的Pm17基因所在的1RS染色体易位到1BL染色体上，育成了新的1BL.1RS小麦品种(Hsam et al., 1995)。由于与Pm8基因来源不同，且位于1AL.1RS易位染色体上，起初以为Pm17是与Pm8独立的抗白粉病基因，但之后通过等位性测验研究证实Pm17和Pm8是等位基因。
Singh等(2018)仍以Pm3启动子区的184-bp DNA片段作为探针进行Southern杂交，在携带Pm17基因的小麦品种Amigo、TAM-200、Hugenoot和Embrapa16中检测到了特异性条带，推测Pm17和Pm3、Pm8同源，因此作者也采用同源克隆方法来克隆Pm17。使用特异性引物可从Amigo中扩增到三个特异性条带(AU、AM、AL)，其中AM序列在Insave、Amigo、TAM-200和Embraba16中完全相同，于是AM被视为Pm17候选基因。作者利用基因枪介导的瞬间表达技术验证了候选基因的功能，发现候选基因对无毒菌株07227的吸器指数显著降低，而对毒性菌株07230的吸器指数无显著变化。随后，将候选基因构建到玉米泛素启动子下游，导入感病小麦Bobwhite，所获转基因株系对无毒菌株07227呈现抗性，但对毒性菌株07230表现为感病(图4)，从而证实所获的候选基因就是Pm17。
从DNA序列一致性看，Pm3等位基因之间高达97%，Pm8与Pm3b的一致性为81%，与中国春同源基因Pm3CS的一致性为87%。Pm8的编码蛋白为1375 aa，而Pm3b编码蛋白为1415 aa，它们的CC结构域序列高度保守，而LRR结构域存在较大的序列变异，表明LRR结构域承受了多样化选择(Hurni et al., 2013)。Pm17的编码蛋白也为1375 aa，与Pm8编码蛋白的一致性为82.9%(Singh et al., 2018)。Singh等(2018)根据公布的中国春基因组信息在Pm3CS位点发现6个Pm3同源基因，进而对这些基因和Pm3、Pm8、Pm17进行比较分析，发现在Pm3、Pm8、Pm17的上游存在一段保守序列，而Pm3CS旁系同源基因(paralog)没有这段序列，由此推测，Pm17是Pm8的等位基因，且两者都是Pm3的直系同源基因(ortholog)。
图4 Pm17基因的功能验证(Singh et al., 2018)
3. Pm3同源基因之间的抑制及机理
一些研究表明，Pm8基因在有些小麦背景下无法表达抗性，这种抑制现象受到不同位点控制，其中一个位点与Pm3有关(Hanusova et al., 1996; Ren et al., 1996; McIntosh et al., 2011)。Hurni等(2014)分析了六份携带Pm8的材料，其中四份(Kavkaz/4*Federation、Benno、Ambassador 和Veery#6)具有Pm8特异抗性，而另外两份(Veery#5和Florida)没有Pm8抗性。分子检测发现，前四份材料中都没有Pm3基因，而后两种材料分别具有Pm3的两个等位基因Pm3_8152和Pm3CS(表1)。将Kavkaz/4*Federation与中国春(Pm3CS)杂交也观测到了Pm8抗性受抑制的现象。随后，将Pm3CS导入携带Pm8的小麦品种(Kavkaz/4*Federation、Benno和Ambassador)，能显著提高Pm8对无毒菌株07230的吸器指数，直接证实了Pm3CS(SuPm8)对Pm8抗性的显性抑制作用。将Pm3a、Pm3f和Pm3b转基因株系分别与Pm8转基因株系杂交，证实这三个Pm3等位基因也能抑制Pm8对无毒菌株的抗性。而反过来，Pm8对Pm3抗性仅存在部分干扰。
表1 Pm8和Pm3在小麦品种的分布(Hurni et al., 2014)
Hurni等(2014)利用qPCR检测基因的转录水平发现，在同时携带Pm3等位基因和Pm8基因的材料中，Pm8的转录水平并没有下降，而Western杂交则揭示了PM8蛋白的积累水平也正常，由此推测，抑制效应可能发生于翻译后水平。对此，作者利用本生烟叶片瞬间表达体系和免疫共沉淀技术检测PM3和PM8的互作情况，证实两者确实存在蛋白水平的互作，而且Pm3CS和Pm3b的表达能抑制PM8自激活变异蛋白引起的本生烟细胞死亡(图4)。
图4 PM3-PM8在蛋白水平的互作和效应(Hurni et al., 2014)
Stirnweis等(2014)将携带不同Pm3等位基因的转基因小麦进行杂交，观察到不同的Pm3等位基因之间也可能存在抗性抑制的现象，如Pm3a和Pm3b、Pm3b和Pm3f之间都存在抗性抑制，这种抑制也是由同源蛋白的互作造成的。作者进而把Pm3b拆分成不同的片段进行表达，发现LRR结构域的N端部分(Pm3b_Sp-LRR15myc，aa 525–983)和C端部分(Pm3b_LRR15-ENDmyc，aa 949–1415)都参与了对Pm3f引发的细胞死亡的抑制作用(图5)。
图5 PM3b-PM3f在蛋白水平的互作和效应(Stirnweis et al., 2014)
4. Pm8/Pm17基因新等位变异的发掘和育种利用
参考文献：
曹廷杰，陈永兴，李丹，张艳，王西成，赵虹，刘志勇 (2015) 河南小麦新育成品种(系)白粉病抗性鉴定和分子标记检测. 作物学报 41(8):1172-1182
任树新，吴郁文，McIntosh RA， 张翠兰，刘春光， Sharp PJ，The TT, 张炎 (1997) 抑制Pm8抗性表达的遗传学研究及Pm8抗性抑制基因的染色体定位. 遗传学报 24(4):336-343
任天恒，陈放，张怀琼，晏本菊，任正隆 (2011) 1RS.1BL易位在川农号系列小麦新品种选育中的作用. 麦类作物学报 31(3):430-436
吴秋红，陈永兴，李丹，王振忠，张艳，袁成国，王西成，赵虹，曹廷杰，刘志勇 (2018) 利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因. 作物学报 44(1):1-14
Friebe B, Heun M & Bushuk W (1989) Cytological characterization, powdery mildew resistance and storage protein composition of tetraploid and hexaploid 1BL/1RS wheat-rye tanslocation lines. Theoretical and Applied Genetics 78: 425-432.
Hsam SLK, Cermeno MC, Friebe B, Zeller FJ (1995) Transfer of Amigo wheat powdery mildew resistance gene Pm17 from T1AL.1RS to the T1BL.1RS wheat-rye translocated chromosome. Heredity 74:497-501
Hurni S, Brunner S, Buchmann G, Herren G, Jordan T, Krukowski P, Wicker T, Yahiaoui N, Mago R, Keller B (2013) Rye Pm8 nd wheat Pm3 are orthologous genes and show evolutionary conservation of resistance function against powdery mildew. Plant Journal. 76: 957–96
Hurni S, Brunner S, Stirnweis D, Herren G, Peditto D, McIntosh RA, Keller B (2014) The powdery mildew resistance gene Pm8 derived from rye is suppressed by its wheat ortholog Pm3. Plant Journal.79: 904–913.
McIntosh RA, Zhang P, Cowger C, Parks R, Lagudah ES (2011) Rye-derived powdery mildew resistance gene Pm8 in wheat is suppressed by the Pm3 locus. Theoretical and Applied Genetics.123: 359–367.
Ren SX, McIntosh RA, Sharp PJ & The TT (1996) A storage protein marker associated with the suppressor of Pm8 for powdery mildew resistance in wheat. Theoretical and Applied Genetics 93: 1054-1060.
Ren TH, Yang ZJ, Yan BJ, Zhang HQ, Fu SL, Ren ZL (2009) Development oand characterization of a new 1BL.1RS translocation line with resistance to stripe rust and powdery mildew resistance of wheat. Euphytica 169:207-213
Singh SP, Hurni S, Ruinelli M, Brunner S, Sanchez-Martin J, Krukowski P, Peditto D, Buchmann G, Zbinden H, Keller B (2018) Evolutionary divergence of the rye Pm17 and Pm8 resistance genes reveals ancient diversity. Plant Molecular Biology. 98:249–260.
Stirnweis D, Milani SD, Brunner S, Herren G, Buchmann G, Peditto D, Jordan T, Keller B (2014) Suppression among alleles encoding nucleotide-binding–leucine-rich repeat resistance proteins interferes with resistance in F1 hybrid and allele-pyramided wheat plants. Plant Journal. 79: 893–903.