无痛地检测肺癌基因
【学习笔记】
1 肺癌比较常见，研究得比较清楚
在全部癌症中，肺癌是比较常见的种类。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)两大类，其中NSCLC又包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌4种。在肺癌中， NSCLC是主要的，占85%以上；小细胞癌比较少见，只占15%以下。在NSCLC中，腺癌最多，鳞癌其次。我国NSCLC患者约占全部恶性实体瘤患者的1/3。
腺癌（NSCLC的一种）的发病机制研究得比较清楚，其他种类肺癌的发病机制还在研究中。腺癌的驱动基因变异目前已经明确了大约80%。亚洲人最常见的原因是EGFR基因发生了变异，其次是ALK、ROS1、KRAS等基因发生了变异。随着新发现的肿瘤驱动基因变异不断增多，治疗NSCLC的靶向药也逐渐增多。
2 精准治疗成为主导
随着认识的不断深入，肺癌的治疗模式也在完善变化，治疗效果越来越好。除了手术、放疗、化疗，先进的精准治疗逐渐成为主导。精准治疗又有两个方向：靶向治疗和免疫治疗。
2.1 靶向治疗
靶向治疗采用靶向药进行，我认为它其实也属于化疗的一种。靶向药专门与导致肺癌的异常基因相结合，抑制其功能，从而治疗对应种类的癌症。尽管正常基因与变异基因之间的差别非常微小，靶向药物还是能够精细地区分它们，只抑制变异基因，不干扰对应的正常基因。所以这种疗法叫做精准治疗。而一般的化疗药物针对活跃分裂的细胞，这类细胞当中既有癌细胞，也有正常细胞，比如小肠内皮细胞和毛囊细胞。普通化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会误伤这些正常细胞，导致一些副作用。靶向药针对基因变异，传统的化疗药针对具有分裂能力的细胞，这就是靶向药与普通化疗药的区别。
由于肺癌研究得比较清楚，治疗肺癌的靶向药也已经开发成功了很多种。这是好的一面。针对腺癌EGFR基因变异的靶向药已经有三代了，很快还会有第四代。针对鳞癌（属于NSCLC的一种）的靶向治疗，不吸烟女性推荐进行基因检测，吸烟男性不推荐基因检测。
2.2 免疫治疗
如果要开展免疫治疗，除了检测PD-L1，还可以检测肿瘤变异负荷（tumor mutational burden，TMB）。尽管支持TMB的证据目前还不是很强（研究中），但在靶向治疗、化疗等多线治疗失败后，考虑免疫治疗的患者可以进行TMB检测，其中TMB高的患者推荐进行免疫治疗。
目前已有多个针对NSCLC的免疫治疗方案获得了批准，但是临床如何筛选免疫治疗适用人群是一大挑战。TMB提供了比较全面的分子生物学信息，可作为免疫治疗的方案选择、预后判断和临床试验入组依据。
小细胞肺癌的基因背景更复杂，其靶向治疗研究困难重重，靶向药成功的很少，因此其精准治疗的现状和思路都与NSCLC不一样，其免疫治疗的表现反而比靶向药物稍好一点。与标准化疗方案相比，一线PD-L1抑制剂的几个药物和化疗联合，中位生存期提高了2个月。虽然获益不大，毕竟有所获益，因此有些医生会为这类患者做TMB检测，在举棋不定的时候利用TMB信息帮助决策。
3 基因检测伴随精准治疗
肺癌患者如果需要开展靶向治疗和免疫治疗，都要先进行基因检测。只有基于基因检测的结果，医生才能选对具体的精准治疗方案。精准治疗不光药物是精准的，它对于患者的要求也是精准的，一把钥匙开一把锁。
肿瘤基因检测可以分为两大类：一是检测基因变异，目的是找到不同患者具体是哪个基因发生了哪种变异。其判断思路是：正常的基因是好的，变异的基因是致癌的。一是检测肿瘤变异负荷(TMB)，这需要一次性检测大量基因（通常是3百个以上，最好检测人类的全部基因）并进行计算，目的是测定变异在整个基因组中的占比。其判断思路是：TMB越小，基因变异的整体危害性越小。
3.1 肿瘤基因变异检测
传统的基因检测技术（如PCR）覆盖基因有限，存在漏检风险，可能因组织样本耗竭而影响后续的进一步检测，不能完全满足临床需求。全面的肿瘤相关基因检测是改善NSCLC患者治疗效果和预后的关键。而NGS技术能够实现基因组范围的全面检测，国内外的治疗指南都推荐对肺腺癌进行基于NGS技术的基因检测。
目前国内外已发表了多个关于NGS检测的技术指南和专家共识。但现有的NGS指南侧重于检验科室的技术参数标准，缺乏可指导NGS检测在实体瘤临床诊疗路径中应用的指南或共识。完善而准确的肿瘤基因诊断结果可为临床医师制订治疗策略和判断预后提供参考依据，因此NGS检测的应用也逐渐变得越来越广泛。
3.2 肿瘤变异负荷检测
进行TMB检测，理论上需要进行全外显子组测序（WES），根据测序数据进行计算。但是WES成本比较高，临床开展有困难，因此，目前常用更加经济实惠的大panel进行替代。已有两个大panel获得了FDA批准：FoundationOne公司的F1CDX和纪念斯隆凯特琳癌症研究中心（MSK）的MSK-IMPACT。它们各自覆盖300-400个基因，虽然比WES覆盖的大约3万个基因少很多，但是足够进行TMB计算。
4 液体活检具有无创优势
4.1 血液检测和组织检测
按照所使用的样本类型，肿瘤基因检测方法可以分为两类：一种是以固体的组织材料为样本，包括手术获得的新鲜冷冻组织样本，穿刺获得的小标本，石蜡包埋组织样本（FFPE）等，一般称为组织活检；一种是以血液、尿液、唾液、脑脊液、肺泡灌洗液等液体为样本，检测的基因可以来源于循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌体等，一般称为液体活检。
液体活检的取样方法是微创的甚至无创的。对于同一个病人，液体活检所提供的基因变异信息与组织检测得到的信息是一样的，可用于帮助临床治疗决策。无创的肿瘤液体活检具有很大优势，代表了肿瘤基因检测的发展方向。
4.2 循环肿瘤DNA
肿瘤细胞凋亡后，会释放一些断裂的DNA片段到血液里，随着血液循环遍布全身，形成ctDNA。ctDNA完整保留了肿瘤细胞基因变异的各种特征。把这些ctDNA分离提取出来用于基因分析，其检测结果可代表患者的整个肿瘤特性。血液ctDNA检测是目前液体活检中相对比较成熟的技术，已被写入了很多指南。它的优势有3点：
第一，可及性。相比穿刺和手术，抽血是比较简便的。以血液作为基因检测的样本便于反复取样。
第二，全面性。对于多脏器多部位转移的晚期肺癌患者，由于肿瘤异质性，仅仅取某个部位的肿瘤组织往往难以完整反映整个肿瘤的全貌。但是血液里的ctDNA来自于不同原发和不同转移部位的肿瘤，无论哪个部位，肿瘤细胞坏死都会释放DNA片段到血液里去，混合在一起，天然具备代表性。克服了组织活检的局限性，能够更完整地反映肿瘤基因变异的全貌。
第三，实时性。可以实现动态监测。一旦疾病进展，重复组织活检不易取样，这种情况下基于血液的液体活检就非常重要。
4.3 循环肿瘤细胞和外泌体
除了检测ctDNA以外，肿瘤液体活检还可以检测CTC和外泌体。
一部分肿瘤细胞也可以进入血管，随血液循环达到全身各处，这就是CTC。通过专门方法把血液中的肿瘤细胞分选出来，再做进一步的分析包括基因检测，也可以用于肿瘤的精准治疗。目前由于分选技术的局限，CTC的临床应用进展还不是特别好。每次分离最多拿到3-4个肿瘤细胞，考虑到肿瘤的异质性问题，3-4个细胞很难全面反映肿瘤组织的真实情况。与ctDNA相比，CTC面临的挑战更严峻，其应用也更受局限。
外泌体可以用来做基因分析甚至PD-L1表达等，目前还在研究阶段，临床应用还需要更多研究。
5 液体活检要求超高灵敏度技术
在血液中存在的游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）中，既包括来源于肿瘤细胞的变异DNA片段（circulating tumor DNA，ctDNA），也包括来源于正常细胞的正常DNA片段，二者混杂在一起。cfDNA在血液中本来就不多，而ctDNA又只占cfDNA中很小的一部分，检测困难，这就要求肿瘤液体活检技术必须具有千分之一（0.1%）级别的灵敏度。而常规的NGS技术，检测灵敏度为2%，相差一个数量级，无法用于检测ctDNA携带的基因变异。
5.1 标准技术——UMI技术
为了实现千分之一的检测灵敏度，科学家们发明了UMI-NGS技术。UMI是单分子标签。运用UMI技术检测ctDNA，必须要结合开展超高深度NGS测序，测序深度在30000X-120000X之间，在这种情况下可以达到0.1%检测灵敏度，完成肿瘤液体活检。这个技术的缺点是进行超高深度测序导致数据量庞大，需要在NovaSeq等工厂级别的NGS平台上才能实现，一般的临床实验室由于平台不够大而无法开展此项检测。
运用UMI-超高深度测序技术开展ctDNA液体检测，最大的局限是敏感性还不理想。目前最好的敏感性是50%-70%。至少30%的病人可能是假阴性（有变异，但没有检测出来）。但是它的检测特异性比较高，在90%~95%以上，假阳性率很低。也就是说，如果检测出来是阳性，基本可以确认；如果检测结果是阴性，并不意味真的是阴性。
临床首选使用组织标本；如果难以取到组织样本，则可以考虑血液检测作为补充。液体活检要完全替代组织活检，还需要更多数据支撑。
5.2 新兴技术——BDA技术
与UMI技术相比，BDA（阻滞探针替换扩增，blockerdisplacement amplification）技术也具有千分之一的超高灵敏度，但是所需数据量比较小，只需要进行常规深度的（数千X）测序即可，不需要超高深度测序，因而可以在桌面型（即小型）NGS测序仪上完成肿瘤液体活检。
BDA技术使无痛检测肺癌更具可行性，提高了肿瘤液体活检的临床可及性。
6 复发问题就是靶向药耐药问题
精准治疗的复发、转移是肺癌患者特别关心的问题。好在液体活检取样比较方便，如果每隔几个月进行一次肿瘤液体活检，能否比影像学更早地发现复发灶呢？这个问题还可以换一个角度进行表述，那就是：在进行靶向治疗的过程中，肿瘤液体活检能否帮助临床医生提前发现耐药性，以便在临床进展、症状加重之前就进行干预，从而使患者获得更长的生存时间呢？
理论上这是可以的。它是如此重要，以至于各国专家都在开展不同干预时间节点的临床研究。虽然迄今还没有获得很好的结果，大家都在期待。
如果病人有需求，经济条件可以承担，可以提前尝试运用液体活检进行耐药性监测。如果有机会纳入相关研究项目那就更好了，这样的机会一定不要放过。但是目前尚不作为常规推荐，毕竟没有数据支持。