连朴饮加减方阻断慢性胃炎“炎癌转化”经验传承与作用机制研究
目的:(1)探索和总结吕文亮教授运用连朴饮加减方阻断慢性胃炎“炎癌转化”的临床经验;(2)基于网络药理学探讨连朴饮加减方治疗慢性萎缩性胃炎的核心靶标以及网络作用机制;(3)探索连朴饮加减方对慢性萎缩性胃炎炎症微环境、血管新生途径中核心靶标的调控作用。方法:(1)采用文献研究方法,通过收集与查阅国内外有关慢性胃炎“炎癌转化”的文献资料,系统梳理和探讨慢性胃炎“炎癌转化”的病理机制以及中医药学防治理论。(2)采用定性研究方式,运用扎根理论制订访谈提纲,对吕文亮教授进行深度访谈,并对访谈资料进行转录,结合观察法与文献回顾所收集的资料,系统分析和总结吕文亮教授临床辨病辨证主要思维方式、对慢性胃炎“炎癌转化”病因病机的认识、对连朴饮方证的认识以及运用连朴饮加减方阻断慢性胃炎“炎癌转化”的诊疗经验,提炼学术思想。(3)基于网络药理学研究方法,在Sym Map、Dis Ge Net数据库中分别检索获取连朴饮加减方组成中药及慢性萎缩性胃炎的作用靶标。将二者共有靶标作为潜在治疗靶标,并导入STRING 11.0分析平台进行PPI分析,结合Cytoscape3.7.2软件对最低相关系数大于0.9的靶标网络进行计算分析,获取度值最大的前十个靶标作为核心作用靶标;将共有靶标导入DAVID 6.8分析平台进行GO与KEGG富集分析,筛选P值小于10~(-5)且靶标数目大于5个的CC、BP、MF条目进行聚类分析,筛选与慢性萎缩性胃炎病理机制关联最为紧密的信号转导通路,进行作用机制预测。(4)采用实验研究方法,将62只雄性SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(A组)10只、造模组52只。模型组大鼠均采用多因素复合方法复制模型。每日自由饮用量浓度为120mg·L~(-1)的MNNG溶液,且每周(周1、周4)进行2次1ml/100g的MNNG溶液灌胃;进食2天后禁食1次,进食时间内均给予含0.03g·kg~(-1)雷尼替丁的饲料喂养;进食第1天予以56℃15%Na Cl灌胃,每只1ml/100g;禁食当天予以40%乙醇灌胃,每只1ml/100g。连续造模第8、14周后,各随机处死1只大鼠,摘取胃组织,行常规HE染色,镜下观察证实胃黏膜固有腺体萎缩,表明造模成功。在造模期间,造模组大鼠死亡5只。造模成功后将模型组大鼠随机分为模型组(B组)、维霉素组(C组)、黄连厚朴组(D组)、连朴饮加减方组(E组)、连朴饮组(F组),每组9只。C、D、E、F组分别采用维霉素、黄连厚朴、连朴饮加减方、连朴饮干预,灌胃剂量按照成人体重(60kg)日服剂量换算为大鼠日服剂量后进行灌胃,连续干预8周,中药干预期间,D组死亡1只,F组死亡2只。干预结束后,利用水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠,抽取腹主动脉血,离心(3000rpm,10min)后采集血清,用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α含量;摘取一部分胃组织-80℃超低温保存,采用RT-PCR检测胃组织中STAT3 m RNA、JAK2 m RNA、HIF-1a m RNA表达情况,采用WB法检测p-JAK2、p-STAT3相对表达量;另一部分胃组织经10%甲醛溶液固定后,经HE染色观察胃组织形态学改变,并采用免疫组化法检测胃组织中EGFR、VEGF的表达情况。结果:(1)经过定性研究,获得吕文亮教授公开发表的学术论文160余篇,专题报告8篇、讲座音视频5份,跟师笔记8篇,专著2部;访谈总计进行12次,资料转录后提取到4条主题脉络。(2)从数据库中获得药物靶标367个,疾病靶标203个,共同靶标40个。PPI分析发现STAT3、VEGFA、IL6、CXCL8、TNF、IL1B、IL10、TP53、EGFR、AKT1为核心靶标。GO富集获得2个聚类,CC主要涉及细胞外区域,BP主要涉及炎症反应、免疫反应、白细胞介素6介导的正调控,MF主要涉及细胞因子活性。KEGG富集获得条目30条,关联紧密的有PI3K-AKT、HIF-1、MAPK、Fox O等信号通路。(3)实验研究结果:(1)形态学观察发现:在造模14周时,大鼠胃组织色泽暗淡,褶皱低平,部分组织疣状隆起。实验干预8周后,A组大鼠胃黏膜组织色泽淡红明润,表面光滑,皱襞规整,覆盖少量粘液;B组大鼠胃黏膜组织色泽晦暗,皱襞低平,厚度变薄,表面疣状隆起。各治疗组,胃组织呈暗红色,规整,表面少量疣状隆起。经HE染色,镜下观察发现:A组大鼠胃组织上皮完整,细胞排列规整,腺体排列密集,无肠化及炎症;B组胃黏膜大量炎症浸润,腺体减少萎缩,排列不规整,上皮肠化生,C、D组炎症细胞浸润程度降低,萎缩程度减轻,仍可见肠化生;E、F组炎症轻度浸润,E组轻于F组。(2)ELISA检测发现:B组血清IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α含量较A组显著升高(P<0.05);D、E、F组较B组显著降低(P<0.05);在IL-6、IL-17、TNF-α水平上C组较B组显著降低(P<0.05),E、F组显著优于C组(P<0.05);在IL-17水平上,F组优于D组(P<0.05),E组优于F组(P<0.05);在TNF-α水平上,E、F组显著优于D组(P<0.05)。(3)免疫组化检测发现:B组胃组织中EGFR、VEGF表达显著高于A组(P<0.05),E、F组较B组显著下降(P<0.05),E组显著低于D、F组(P<0.05);在EGFR表达上,C、D组较B组显著降低(P<0.05),E组显著低于C组(P<0.05);在VEGF表达上,E、F组较C组显著降低(P<0.05)。(4)RT-PCR检测发现:B组胃组织中STAT3m RNA、JAK2 m RNA、HIF-1a m RNA水平显著高于A组,E组较B、C、D组显著降低(P<0.05);在STAT3 m RNA水平上,D、F组较B组显著降低(P<0.05),F组较C、D组显著降低(P<0.05);在JAK2 m RNA水平上,E组较F组显著降低(P<0.05);在HIF-1a m RNA水平上,E组较B、C组显著降低(P<0.05)。(5)WB实验发现:B组p-STAT3、p-JAK2相对表达量显著高于A组(P<0.05);在p-STAT3相对表达量上,E组较B组显著降低(P<0.05);在p-JAK2相对表达量上,C、D、E、F组较B组显著降低(P<0.05)。结论:(1)连朴饮是吕文亮教授临床治疗慢性胃炎脾胃湿热证的常用方,在病证结合、方证相应的思维模式下,结合慢性胃炎“炎癌转化”过程中表现出的病证特征,认为:湿热伏邪、湿热致瘀是这一病理演变过程中的关键病因病机,临床以连朴饮方证为基础,在化湿清热的基础上,辅助以活血化瘀药的连朴饮加减方适用于慢性萎缩性胃炎的临床治疗,疗效显著。(2)连朴饮加减方可通过下调血清炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的表达量与抑制胃组织中STAT3 m RNA、JAK2 m RNA表达以及p-JAK2、p-STAT3水平,改善炎症微环境,修复胃黏膜形态;并通过下调EGFR、VEGF以及HIF-1a m RNA的表达量,抑制血管新生,进而对慢性萎缩性胃炎发挥治疗作用,其作用机制可能还涉及多种生物学途径中的多个靶标。...