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Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease小鼠肾脏的转录组学单细胞测序揭示了肾脏疾病的潜在细胞靶点

一.研究背景

肾脏是由多个部分组成的进行多种复杂功能的器官。其中，肾小球可过滤血液产生水和溶质；近端小管进行重吸收功能，重新大量的水和电解质；Henle环主要涉及溶质的浓缩；远端小管和集合管调节溶质运输。在肾脏中目前仅有有少量的基因被注释，因此通过单细胞测序并进行聚类，可以重新定义肾细胞类型，且有助于发掘出新的肾细胞类型，同时有利于发掘出肾脏疾病的机制。另外使用单细胞测序分析可以识别相同的细胞类型以及区分原代细胞和传代细胞。

二.分析流程

三.结果解析

1.小鼠肾脏细胞的单细胞测序和无偏聚类

  • 图1A：对7只小鼠全肾细胞悬液的57,979个细胞进行分离和测序，同时进行质量控制（过滤线粒体基因超过50%）后进一步分析43,745个细胞，随后进行无偏聚类得到16个细胞簇，并确保来自7个肾脏的细胞平均分布在16个细胞簇中。

  • 图S2：确定质量控制的阈值以排除线粒体基因的影响：tSNE图显示线粒体基因表达的百分比（图S2A ）；所有基因进行无偏聚类生成的tSNE图（图S2B）；展示图S2B集合管细胞标记的表达（图S2C）；过滤线粒体基因超过20%的tSNE图（图S2D）；展示图S2D集合管细胞标记的表达（图S2E）

  • 图S3：对线粒体高表达基因使用GO富集分析，发现线粒体高表达基因和线粒体编码蛋白相关用于溶质运输，而非细胞应激反应，同时表明线粒体基因表达增加是肾脏细胞特有的类型

  • 图S4：通过两种不同方法识别细胞类型进行验证，第一种为对表达基因进行PCA，后对排名前20的PCs进行tSNE分析；第二种为对表达基因进行PCA，然后选择排名前100或后100的基因进行tSNE分析

图1. 肾脏细胞的分类和注释

图S2S3. 质量控制（排除线粒体基因表达的影响）

图S4. PCA验证分类结果

2.基于细胞类型特异性标记基因对肾细胞的分类

  • 图1B：通过表达差异基因分析和IHC分析，得到每个细胞簇的特异性标记基因，且这些标记基因大多为已知的基因如：Kdr、Nphs1、Nphs2、Slc12a1和Slc12a3；但仍有少数额外的标记物此前未发现如：Cdkn1c和Bcam。

  • 图1C：进一步分析细胞簇1、3和7，得到了8个亚群，其中细胞簇1可以分成内皮细胞亚群、周细胞/血管平滑肌/肾小球样细胞亚群和髓襻细胞降环亚群；细胞簇3（近端小管）分为S1、S2和S3；细胞簇7（闰细胞）可分成A型和B型。

  • 图S8：通过单细胞测序与不同肾节段bulk RNA sequence 的相关性分析验证注释结果

  • 图S9：通过单细胞测序与免疫细胞类型微阵列数据（数据来源Immunological Genome Project）的相关性分析验证注释结果

  • 图S10：使用绿色荧光蛋白（GFP）标记足细胞、内皮细胞和肾小管细胞验证分类

  • 因此，作者通过单细胞转录测序定义了18种已知的肾细胞类型和3种新的细胞类型

图S8. 外部数据验证注释结果

图S9. 外部数据验证注释结果

图S10. 荧光蛋白验证注释结果

3.单基因遗传病致病基因具有细胞类型特异性

  • 图2A：对于29个人类蛋白尿单基因遗传相关基因，有21个且仅在小鼠的一种细胞类型（肾小球足细胞）中表达。同时，人体中的肾小管性酸中毒相关基因仅在集合管闰细胞表达；涉及血压的基因仅在远曲小管或仅在集合管的主细胞中表达；慢性肾病和血浆代谢物水平相关基因在近端小管中表达。

  • 因此，作者得出结论：相同表型的单基因遗传性肾脏疾病来自相同的细胞类型。

图2. 在小鼠中人类单基因遗传病致病基因表达情况

4.肾脏集合管鉴定出新型细胞类型

  • 图3AB：肾脏集合管由于起源于输尿管芽，因此至少存在三种的细胞类型：主细胞（PC）负责钠、水重吸收和钾分泌；α闰细胞（A-IC）负责酸分泌；β闰细胞和（B-IC）负责碱分泌。作者使用水通道蛋白2（Aqp2）和H + -ATP酶亚基（Atp6v1g3）来定义PC和IC细胞。并且在细胞簇8中Aqp2和Atp6v1g3标记基因同时表达阳性。

  • 图3C：使用AQP2和ATP6V1B1免疫荧光染色，验证Aqp2和Atp6v1g3基因在细胞簇8表达。

  • 图3DE：对3种PC、IC和双阳性细胞进行原位杂交并表达差异分析，展示三个细胞簇基因表达情况.

  • 图3F：对新发现的细胞进行PARM1（IC特异性）与AQP2或ATP6V1B1双重染色，证明细胞簇8为双阳性的细胞。

  • 图3G：使用Monocle进行伪时间分析，发现细胞簇8为形成PC和IC的中间状态的过渡细胞。

  • 因此，肾脏集合管中不但包含PC和IC细胞也包含了过渡状态的细胞。

图3. 鉴定出IC和PC转化过程中过渡状态的细胞

5.荧光谱系追踪证实集合管细胞的可塑性

  • 图3HI：为了在小鼠体内验证集合管具有细胞簇8的过渡细胞，作者构建带有Aqp2谱系标签的主细胞和带有Atp6标签的闰细胞的小鼠进行谱系追踪实验，并成功证实在小鼠体内PC和IC细胞互相转化。

  • 图S18:图A通过tSNE图展示各个细胞簇的细胞周期，其中灰色虚线为细胞簇678，没有处于有丝分裂间期；图B展示细胞周期相关蛋白富集的细胞簇，细胞簇8不富集；图C在IC和PC转化细胞轨迹图上，没有细胞周期相关蛋白富集，因此，新发现的细胞不为IC和PC的祖细胞。

S18. 排除新的细胞类型为祖细胞的可能

6.Notch通路调控集合管细胞的可塑性，导致慢性肾脏疾病出现中异常的细胞群

  • 图S19：作者进一步分析了IC与PC在细胞转化过渡过程中表达差异的基因。图S19A展示基因表达展示了差异基因；图S19B展示不同表达的标记基因；图S19C展示了差异基因的功能。

S19. 鉴定IC与PC转化过程的差异基因

  • 图4A：进一步分析差异基因发现Notch信号通路被激活，其中PC中Notch配体低表达，而IC中高表达

  • 图4B：通过免疫荧光实验，展示了Notch配体JAG1在IC细胞表达，同时其排斥Aqp2表达。

  • 图4C：构建了Notch过表达的小鼠，在小鼠中PC细胞增加，IC细胞减少

  • 图4D：通过去卷积分析RNA数据验证了IC与PC比例。

  • 因此，Notch的表达驱动IC到PC细胞的转变。

  • 图4EG：在叶酸处理的小鼠导致IC细胞和PC细胞无法相互转换，因此AQP2 +细胞增加，而ATP6V1B1 +细胞。

  • 图4F：通过反卷积分析RNA数据验证了叶酸处理IC与PC比例。

  • 图4H：对CDK患者的肾脏活检的反卷积分析，Notch信号和HES1表达增加。

  • 图4I：叶酸诱导的小鼠CDK模型，血液CO2水平降低。

  • 因此，IC向PC的转变是由Notch配体（IC）和受体（PC）的表达介导的；在小鼠模型和CKD患者中，IC向PC细胞的转变可能是引起代谢性酸中毒的原因。

图4. Notch通路介导IC向PC转变

小结

最后小结一下，作者使用单细胞测序和无偏聚类对来自健康小鼠肾脏的57,979个细胞构成的16个基因簇进行了注释。基于基因表达模式，作者推断遗传的肾脏疾病源于不同的基因突变，但相同表型的单基因遗传性肾脏疾病来自相同的细胞类型。作者还鉴定出成年小鼠的肾脏集合管的新型的过渡细胞，随后通过计算细胞轨迹分析和体内谱系追踪显示，闰细胞（IC）和主细胞（PC）是由Notch信号通路介导的转变，存在过渡状态的细胞，且可能与代谢性酸中毒有关。

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