新思路!标志物居然还能这样做!

Xenotransplantation (IF=3.484) 上的一篇文章:“Epigenetic biomarkers indicate islet cell death in xenotransplantation”。作者通过焦磷酸测序对猪胰岛INS基因上的CRE2和intron 2区域进行甲基化定量分析,并提出CRE2和intron 2区域低甲基化可作为生物标志物提示胰岛细胞死亡。作者进一步对生物标志物的灵敏度进行检测,评估了低甲基化检验灵敏度和引物灵敏度,并通过动物实验进行验证。最后作者使用抗组蛋白H3抗体进行ChIP-seq,定位了INS基因上的增强子。

Epigenetic biomarkers indicate islet cell death in xenotransplantation

一种提示异种移植中胰岛细胞死亡的表观遗传学生物标志物

一、研究背景

猪胰岛异种移植是近十几年出现的一种1型糖尿病(T1D)的潜在治疗手段。目前判断胰岛移植成功与否的检测指标多为血糖、C肽、循环抗体等,然而指标水平的变化通常发生在胰岛细胞死亡后。相关研究报道,胰岛β细胞中胰岛素的产生依赖于胰岛素基因INS调控区CpG岛的低甲基化。因此,作者提出通过循环游离DNA(cfDNA)中INS基因低甲基化水平作为移植物功能障碍的早期指标。

二、分析流程

三、结果解读

1. 猪INS基因低甲基化区域的定义及引物设计

CRE2为cAMP应答元件(CRE)结合区的第二个,也是猪INS基因的潜在启动子区。尽管CRE2在哺乳类动物中高度保守,然而包括猪在内的个别动物其CRE2的中心CpG岛仍然存在一定突变(图1)。相关报道显示,该CpG岛的甲基化水平影响cAMP应答元件结合蛋白(CREB)的结合亲和力并能调控胰岛素表达。

图1. 胰岛素基因启动子区CRE2的保守性

1.1 CRE2的引物设计

由于NCBI数据库中有关猪的基因序列质量不佳,因此作者选择基于5’UTR设计引物。作者使用NCBI数据库中猪的基因序列(Landrace AY242108)设计通用测序引物,并对舒尔茨糖尿病研究所(SDI)猪供体处获得的组织DNA进行Sanger测序。

经PCR扩增和Sanger测序序列分析对比后,作者建立了250 bp的SDI共有序列,记为5pC(图2)。作者使用PyroMark Assay Design Software Version 2.0 (Qiagen),选取-544 TSS至-314 TSS作为SDI猪的特异焦磷酸测序引物,该区包含CRE2结合位点。

图2. 5pC和IntA序列

1.2 intron2的引物设计

有研究报道了鼠和人intron2的CpG位点低甲基化,因此作者选择基于intron2设计引物。作者使用PyroMark Assay Design Software Version 2.0 (Qiagen),选取+299 TSS至+465 TSS作为SDI猪的特异焦磷酸测序引物,该区为猪特有的基因序列。经PCR扩增测和Sanger测序序列分析对比后,作者建立了236 bp的SDI共有序列,记为IntA(图2,图3)。

图3. 不同物种间INS序列对比

2. 通过焦磷酸测序进行甲基化水平定量

将胰岛组织和非胰岛组织(脾、胰腺、肌肉、肺、肾、心、淋巴结、皮肤)中提取的基因组DNA中CRE2所在的5‘UTR区(5pC)和intron 2区域(IntA)进行焦磷酸测序,焦磷酸测序引物如表1所示。作者发现CRE2所在的5‘UTR区(5pC)内3个CpG位点中,胰岛组织甲基化频率低于非胰岛组织;intron2区域(IntA)内9个CpG位点中,胰岛组织甲基化频率同样低于非胰岛组织(图4,表2)。

表1. 焦磷酸测序特异引物5pC和IntA

图4. 胰岛组织和非胰岛组织中的甲基化频率对比

表2. 胰岛组织和非胰岛组织中的甲基化频率检测结果

3. 检验生物标志物的灵敏度

3.1 评估低甲基化检验的灵敏度

将猪胰岛基因组DNA(gDNA)掺入非人灵长类动物(NHP)食蟹猴血液、血浆、血清中,随后进行DNA提取、10倍连续倍比稀释、使用焦磷酸测序引物5pC和IntA进行PCR扩增。作者发现无论是血液、血浆、血清中都可以检测到猪胰岛DNA,且血浆对此灵敏度最高(图5)。

图5. 食蟹猴血液、血浆、血清中检测猪胰岛gDNA

3.2 评估引物灵敏度

作者发现CRE2所在的5‘UTR区(5pC)焦磷酸测序引物的最低检测极限为2000-20000个细胞,而intron2区域(IntA)焦磷酸测序引物的最低检测极限可达到1-10个细胞(图6)。

图6. 对CRE2和intron2区域焦磷酸测序引物的灵敏度测定

3.3 动物实验验证

作者随后进行了动物实验,定时对接受猪胰岛异种移植的免疫抑制NHP进行采血,检测血清中cfDNA浓度。敏感度较高的IntA引物、5pC引物均在NHP死亡当天检测到了胰岛细胞死亡(图7)。

图7. 接受猪胰岛异种移植的免疫抑制NHP胰岛细胞死亡的检测

4. INS基因上的染色质增强子定位

H3K4Me1常作为增强子的标志,因而作者使用抗组蛋白H3抗体(ab8895, Abcam)进行ChIP实验,设计相应引物,最后对富集到的DNA进行qPCR检测。对比位于启动子的5pC区与其上游600bp的序列,作者发现只有胰岛和肝脏两处H3K4Me1修饰富集具有显著差异(图8)。胰岛5pC上游600bp处H3K4Me1修饰富集水平更高,而肝脏的H3K4Me1修饰富集情况则与之相反。

图8. 不同组织中H3K4Me1富集差异

小结

作者通过焦磷酸测序对猪胰岛INS基因上的CRE2和intron 2区域进行甲基化定量分析,发现CRE2所在的5‘UTR区的3个CpG位点和intron2区域(IntA)的9个CpG位点甲基化频率均低于非胰岛组织,提示CRE2和intron 2区域低甲基化可作为胰岛细胞死亡的生物学标志。作者进一步对生物标志物的灵敏度进行检测,评估了低甲基化检验灵敏度和引物灵敏度,并通过动物实验进行验证。最后作者使用抗组蛋白H3抗体进行ChIP-seq,定位了INS基因上的增强子,发现胰岛组织H3K4Me1修饰富集特点。

作者的研究可用于早期检测异种移植物中胰岛β细胞DNA的释放,且经动物实验验证表明该方法敏感性高,在仅有5%移植物死亡时即可检测到。而与之相比,目前判断胰岛移植成功的检测指标血糖敏感性低,只有在出现约65%移植物死亡时才可检测到血糖指标上升。因此,该研究有助于及早发现胰岛细胞死亡,从而为早期干预提供机会。

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