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Characteristics, dynamic changes, and prognostic significance of TCR repertoire profiling in renal cell carcinoma patients
肾细胞癌患者TCR谱分析的特征，动态变化和预后意义
一、研究背景
肾细胞癌（RCC）是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，RCC被认为是一种高度免疫原性的癌症，当免疫细胞耗尽（exhausted）并受到肿瘤的抑制时，免疫抑制常会发生，而T细胞功能障碍在这一过程中起着重要的作用。由异二聚体（α：β或γ：δ）组成的独特T细胞受体（TCR）在每个T细胞的表面表达，最丰富的是TCRβ链（TCRB），研究表明，TCR谱的分析对于了解致癌过程和癌症进展至关重要，而TCR多样性可能是治疗监测和预后评估的良好生物标志物。减瘤性肾切除（CN）手术是以姑息性肾癌手术原则对转移性肾癌的原发病灶切除手术。减瘤性肾切除术作为一种姑息性手段，用以缓解原发灶相关症状，最大限度改善患者生活质量，延长患者生命，虽然存在着争议，但是目前仍有临床的应用价值。
二、分析思路
三、结果解读
1、基线TCRB多样性反映了免疫状态
在与手术相关的队列的80个样本中，共获取到了10,072,661个TCRB克隆型，其中包括术前TCRB样本115,428±62,953（平均±SD）个和术后TCRB样本136,388±48,815（平均±SD）个。
首先，作者探究高还是低TCR多样性对应更好的免疫状态。为了研究TCRB多样性如何反映基线患者中的免疫状态，作者在28名未接受手术治疗的患者中获取RNAseq数据，分析获得的免疫表型评分、干性指数和TCRB多样性指数之间的关系。（患者已经过筛选加入研究但还未开始用药治疗的这一段时间，称为基线期）
作者发现较高的外周血干指数与较高的TCRB多样性相关（图1A），而这提示着幼稚性T细胞含量的增加，也就意味着具有多能分化的潜能和增殖能力。
GSEA分析显示，TCRB较高的多样性与较多数量的T细胞呈正相关（特别是CD4-和CD8-幼稚性T细胞）。相反，与TCRB多样性负相关的基因在炎症反应和凝血过程中富集，特别是在嗜中性粒细胞和血小板的激活中（这被认为是导致预后较差的危险因素）。从图1B中，我们可以看到橙色线代表正相关的terms，绿色线代表负相关的terms，从左到右TCRB多样性逐渐降低。
此外，TCRB多样性和中性粒细胞/淋巴细胞比（NLR）呈负相关，而NLR往往意味着不良预后。
图1A B D
接下来，作者选取162个与TCRB多样性正相关的的基因进行GO分析。图1C中可以看到，前20个terms主要是与生物合成与代谢过程有关，特别是前5个terms中的基因主要是核糖体基因（据报道它们在幼稚T细胞中表达）
图1C：GO分析的结果
2、不同肿瘤负担患者的基线免疫状态差异
为了探讨不同肿瘤负荷对免疫系统造成的压力，作者在未经过治疗的RCC患者中（基线期）分析并比较了TCRB的多样性和各种免疫细胞亚型的功能状态。得出结论：IV期患者的肿瘤负担破坏了免疫系统的功能。
结果显示，四种类型的T细胞多样性指标一致表明良性和I期RCC患者的术前TCRB多样性要显著高于IV期患者。具体来看：在I期患者中观察到的TCRB计数高于IV期患者（图2A、B）I期患者中前25,000种TCRB的总比例低于IV期患者（这意味着I期患者的TCRB种类更多）（图2C、D)总体而言，I期RCC患者的术前TCRB多样性明显高于IV期患者。但是，对于术后TCRB多样性，这些指标并没有显著的统计学差异（pre-operation为术前 post-operation为术后）
图2A-D
对免疫细胞亚群的分析显示出了同样的结果：术前II-IV期肿瘤患者的T细胞和CD8活性比I期肿瘤患者低，但术后7天无差异。RNA-seq分析显示，手术前的II-IV期患者的疲乏（exhausted）T细胞比例比I期患者高。图3左图是术前的情况，右图是术后情况，可以看到术后I期和II-IV期并无显著差异。
图3
3、基线TCRB的多样性与预后相关
与其他癌症相似，同一阶段的RCC患者往往有着不同的预后，作者认为TCRB的多样性可以作为预测预后情况的指标，所以对TCRB多样性与预后的关系进行了研究。作者发现，对于IV期患者，TCRB多样性高意味着更好的OS。不过由于随访时间的限制，作者对I-III期患者的情况没有深入了解，所以具体的预后情况有待于接下来的研究。图4展示的是Cox分析的结果（三行对应了三种指数的结果）
图4
4、减轻的肿瘤负担可恢复晚期RCC患者的免疫状态
这个结论承接第二个结论，在第二个结论中，作者得出：晚期患者的肿瘤负担会破坏免疫系统的功能。那么如果减轻肿瘤负担，免疫功能能否有所恢复呢？这无疑在临床治疗中具有重要意义，作者便针对这一点做了研究。
结果表明，通过手术缓解了大多数肿瘤负荷后，IV期患者的TCRB多样性显著增加。例如，图5A显示术后TCRB的克隆数增加；图5B显示术后TCRB多样性指数增加
图5AB：箱线图展示TCRB克隆数和多样性指数的变化
图5C显示术后干性指数也出现了增加，这意味着幼稚性T细胞增加，分化潜能和增殖能力提高。通过RNA-seq估算的免疫细胞亚群的免疫表型评分显示出了相似的结果，因为疲乏（exhausted）的T细胞数量减少了。
为了验证这一结果，作者找到了一位下腔静脉肿瘤血栓形成的III期RCC患者，以分析手术前后疲乏T细胞的变化，发现幼稚性T细胞同样出现了增加（尤其是CD4和CD8）
图5C：干性指数的变化
接下来，作者对其中的机制进行了简单推测。用CN去除原发肿瘤后，IV期患者TCRB多样性的增加可能是因为：在手术过程中肿瘤细胞被破坏后，与肿瘤相关的抗原被释放到血液中，更多的幼稚T细胞被动员以增强识别新释放的抗原的可能性，从而进一步引发免疫反应，恢复免疫状态。
5、手术前后持久和新兴克隆型的改变
除了TCRB多样性之外，每种TCRB克隆型的微观变化也很重要，所以接下来作者研究了克隆型的改变情况。作者将来自同一患者的术前和术后样本中具有相同CDR3氨基酸序列以及Vβ和Jβ基因的克隆型定义为持续性。
研究发现，大多数高丰度克隆型为持续性，为了说明这种现象，作者选择了处于不同临床阶段的四个样本作为代表性患者（图6），发现每位患者持续性克隆型的平均丰度显著高于新兴克隆型的平均丰度。
图6
此外，作者发现在去除原发肿瘤后，IV期患者出现的新兴克隆型比例显著增加。为了探讨去除肿瘤前后持久性克隆型的丰度是否不同，作者研究了每种克隆型的动态变化，结果表明持续性和新兴克隆型的平均浓度均明显降低（注意：二者浓度均降低，不过新兴型的比例增加了）
小结
在这篇文章中，作者先说明基线期RCC患者TCRB多样性与免疫状态相关，而肿瘤负担会降低TCRB的多样性，进而影响免疫状态，不过，通过CN可以减轻肿瘤负担，从而恢复晚期患者的TCRB多样性、改善免疫情况。此外，作者还探究了手术前后克隆型的具体变化，由于数据量不够，关于预后方面的研究做的并不全面。
总体而言，CN可有效改善IV期RCC患者的TCRB的多样性，所以高通量TCR谱测序是反映免疫状态动态变化并预测预后的有效方法。考虑目前的研究进展，作者认为有必要通过一项临床试验来进一步确认在同步转移性RCC患者中，CN对于后续的免疫检查点抑制剂治疗是否必要。