Nature综述：碱基编辑的前世今生

近日（2020年10月19日），Nature Reviews Drug Discovery杂志上发表了一篇题为“Base editing: advances and therapeutic opportunities”的综述性文章，重点介绍了DNA和RNA碱基编辑器，及其治疗相关技术开发的目标；还探讨了当下新兴的治疗方向和相关挑战。

碱基编辑在基因编辑技术领域中的崛起

单核苷酸变体（SNV）约占已知致病等位基因的一半，因此，开发出高效的SNV纠正方法和工具是遗传疾病研究和治疗的重要目标。这些方法需要达到高靶向效率、低脱靶效应、并且具有靶向目标器官的能力。

早期纠正SNV的工具有锌指核酸酶（ZFN）和类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN），但这些方法由于需要为每个新的靶点编辑位点设计和验证新的锌指核酸酶或TALEN蛋白而受到阻碍。

规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）平台的开发和应用为广泛的蛋白质工程需求带来了有力的支持。CRISPR最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂（DSB），从而诱发细胞内的同源重组（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）修复途径，进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。然而，DSB引发的DNA修复很难实现高效稳定的单碱基突变。NHEJ容易引起随机插入和缺失，造成移码突变，进而影响靶基因的功能；HDR尽管精确性高于NHEJ，但是其在细胞中的同源重组修复效率低。

碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术，可以在不切断核酸骨架的情况下实现单核苷酸定点突变，在基因组和转录组编辑过程中能够直接化学修饰靶核碱基。

碱基编辑器主要可分为DNA编辑器和RNA碱基编辑器。DNA碱基编辑能够对基因组进行不可逆的、永久的改变，而RNA碱基编辑则对细胞遗传物质进行可逆修改或RNA表观转录修饰。DNA碱基编辑器可以进一步分类为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（ABE）；其中CBE能够将DNA 的A、T、C和G四种碱基中的靶位点C·G向T·A转变，而ABE则可将靶位点的A· T转变成G·C。

随着碱基编辑系统的开发及不断的优化发展，目前，已经开发出第4代碱基编辑器（BE4）、无RNA的DddA衍生型胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）、能够编码单个TadA域的ABE8e等DNA编辑器；以及REPAIR、RESCUE等RNA编辑器。

碱基编辑的治疗相关目标和挑战

基于原有的碱基编辑系统，目前的碱基编辑技术已有了很大程度的改进。治疗相关的优化目标有以下几点：

➤ 减少脱靶活性；

➤ 提升CBE的纯度；

➤ 扩展靶向范围；

➤ 最小化“旁观者”突变；

➤ 开发新的碱基编辑器

▲ 针对不同终点，DNA碱基编辑器修饰部分的汇编（整图见nature）

除此之外，在体内有效地将碱基编辑器递送到相关的适当组织器官，对于它们作为治疗药物的使用至关重要，也是极具挑战的。

▲ 碱基编辑器递送策略（图片来源：nature）

电穿孔通过脉冲电流在细胞膜上产生短暂的破裂，具有很高的编辑效率，是碱基编辑最常用的递送方法。另外，利用自然界的病毒来递送碱基编辑器是已经成功实践的、有前景的递送策略之一。采用纳米颗粒实现对碱基编辑mRNA和sgRNA的体内递送也具有着重要的临床应用价值。然而，免疫原性仍是大多数递送方式所面临的挑战。这篇综述中也详细给出了不同递送策略的优势和困难。

▲ 递送策略概述（整图见nature）

碱基编辑在基因治疗中的应用

碱基编辑系统为生命科学领域带来了新的曙光。在植物中，碱基编辑器已被用于引入单个DNA改变以带来更好的收成。然而，在碱基编辑器能够为基因疾病患者提升生命质量之前，仍有很多工作要做。

碱基编辑器也已进行了多方面的动物试验，来逆转肌营养不良症、先天性耳聋等遗传性疾病。在这些病例中，直接纠正导致或参与致病的点突变就可以逆转病症。例如，在Duchenne型肌营养不良症（DMD）小鼠模型中，“A to I” RNA碱基编辑器可以将过早终止密码子转换为Trp，从而恢复抗肌萎缩蛋白。

此外，基于碱基编辑技术的体外工程化异体嵌合抗原受体（CAR）T细胞在肿瘤免疫治疗方面也具有很大的潜力。通过从健康供体收集T淋巴细胞，并利用基因工程（逆转录病毒转导或Cas9/HDR介导的基因组编辑）来产生CAR-T细胞。这些CAR-T细胞能够在识别特定的肿瘤细胞抗原时激活T细胞的免疫反应，从而产生肿瘤细胞特异性的细胞毒性。