Cre小鼠模型构建策略及方法特点

目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说哪种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。

1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。

由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。因此，通过传统转基因技术构建的Cre小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。

应用CRISPR/Cas技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）特定内源基因翻译启始位点; （2）借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。

一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。

关于IRES与2A肽两种连接敲入策略的比较，通常认识是，传统的IRES敲入策略，几乎不会影响内源基因的功能，但也发现，由于传统经典的ES打靶过程中，Neo基因表达成分，或去除其后遗留的相关FRT序列等遗留部分序列，可能会引起内源基因3’ UTR区域结构改变，从而干扰了Cre的表达水平，使其实际表达量会相对低于内源基因本身。而新型2A肽连接敲入方式，Cre表达量与其内源基因表达几乎相似，但由于切割2A肽后，遗留的约17-21氨基酸序列，可以附着于内源基因c-端蛋白，存在潜在影响内源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (P2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。尽管如此，应用敲入3'端策略，已不断赢得其吸引力。

3. BAC转基因Cre小鼠模型：将Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC克隆载体，并将此BAC载体进行受精卵原核注射法，构建BAC转基因Cre小鼠模型。虽然该转基因技术也是随机整合插入，但其具有降低了质粒DNA随机插入引起的位置效应影响，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的杂合缺失有表型等方面的优势。另外，相对于短启动子的表达质粒转基因而言，BAC载体包含了更多的基因表达相关的调控元件序列，因而更能反映内源基因的表达特征。但是，BAC转基因的首建鼠，仍会出现因BAC克隆载体插入位点的不同，而引起Cre表达活性不同的现象。因此，该方法并不能解决传统转基因技术的所有不足，比如，插入位点染色质结构的局部影响作用，以及潜在基因插入突变，造成Cre非真实表达等风险。而且，在BAC转基因Cre小鼠构建的同时，也可能增加了附带相应基因的拷贝数，从而干扰了相关基因功能研究的客观分析。尽管如此，相对于传统较小启动子的Cre表达载体而言，BAC转基因技术还是具有其明显的优势。

4. 安全位点敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型构建策略。为了避免基因随机插入可能导致诸多不利因素影响（比如表达位置影响作用及插入突变等），通过将Cre定点敲入到所谓的“安全” 位点，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位点。其中以Rosa26位点最为常用。

Rosa26位点特点，其本身含有基因转录的广泛启动子，形成mRNA，却无翻译蛋白。所以，该基因无特定功能。借用该基因位点本身的特点与优势，有助于构建全身表达Cre基因单拷贝定点敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位点则比较适合构建组织特异性敲入Cre小鼠模型。