钆塞酸二钠增强磁共振的影像学特征用于评估肝细胞癌CD8肿瘤淋巴细胞浸润和PD-L1表达的研究
导语
研究亮点：
这是一项回顾性队列研究，共纳入120例肝细胞癌（HCC）患者，结果显示：（1）在术前钆塞酸二钠增强磁共振（MRI）特征中，无强化包膜（absence of an enhancing capsule，AEC）和肝胆期（hepatobiliary phase，HBP）瘤周低信号（peritumoral low signal intensity，PLSI）可独立预测高密度CD8淋巴细胞浸润。（2）HBP -PLSI和不规则肿瘤边缘（irregular tumor margin，ITM）可分别预测HCC患者PD-L1表达阳性，以及高密度CD8淋巴细胞浸润和PD-L1表达阳性的组合。（3）钆塞酸二钠增强MRI具有在治疗前识别处于免疫激活状态的HCC患者、预测免疫治疗效果的潜力，有助于制定最佳的免疫治疗策略。
点评专家介绍
王劲 教授
中山大学附属第三医院 放射科主任、主任医师、教授、博士生导师
◆Body Chair, ISMRM Education committee(2020-); Member, ISMRM Nominating committee(2020-)
◆Member, LI-RADS international working group(2017-)
◆美国梅奥诊所(Mayo Clinic, 2019) 客座教授
◆美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD, 2016）客座教授
◆ISMRM摘要、ER、AR、JMRI等杂志审稿人; 2017-2020年度《Abdominal Radiology》杰出审稿人
◆中华医学会放射学分会腹部学组委员
研究背景
HCC是全球第5大常见的癌症以及第4常见的癌症死亡原因[2-3]， 70%~80%的HCC患者确诊时已为晚期，需要接受如靶向治疗等的全身性治疗，而HCC患者对靶向药物的反应率低，只能有限地延长中位生存期。免疫检查点抑制剂治疗在包括HCC在内的多种癌症患者中显示出了良好的初步结果[4-5]，为HCC的治疗带来了希望。纳武单抗和帕博利珠单抗是两种针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的单克隆抗体，可延长晚期HCC的中位生存期和无进展生存期[4，6-7]。然而仅部分患者对这些治疗方案有效，且客观反应率低[6-7]。
先前的研究显示具有PD-L1阳性、高CD8 T细胞密度或存在高含量IFN-γ T细胞特征的肿瘤更易对免疫治疗产生应答[8-10]。PD-L1阳性表达和高浓度CD8细胞浸润的组合是免疫检查点通路在HCC治疗中重要的预后因素[10]，因而它们被认为是用于选择免疫治疗相关候选者的一组预测性组织生物标志物。预测HCC中PD-L1的表达和CD8细胞密度可有助于识别将从免疫治疗中获益更多的患者并制定最佳的联合治疗策略。血清学检测的特异性有限，组织活检属于有创检查，影像特征作为组织活检的补充手段具有无创的优势，而且可用于连续监测。肝脏影像报告及数据系统(LI-RADS)和非LI-RADS的钆塞酸二钠增强MRI特征在评估HCC预后或其他影响HCC预后的重要因素中具有统计学意义[11-15]，而与肿瘤预后相关的生物标志物亦可能具有特殊的影像学特征，对此需要进一步探究。
研究目的
本研究旨在评估术前钆塞酸二钠增强MRI对HCC患者免疫检查点标志物CD8肿瘤浸润淋巴细胞密度和PD-L1表达的预测效能。
研究方法
本研究是一项回顾性队列研究，共纳入120例HCC患者。从2016年1月至2020年6月共120例在根治性切除术前接受3.0T钆塞酸二钠增强MRI检查的HCC患者，被分为训练组（n=84）和测试组（n=36）。2017年1月至2020年4月间接受抗PD-1抑制剂治疗并接受钆塞酸二钠增强MRI扫描的34例晚期HCC患者被纳入一个独立的验证组。使用免疫组化染色检测PD-L1表达和CD8细胞浸润情况。两名腹部放射科医生在不知晓病理结果的情况下，根据LI-RADS v2018和非LI-RADS特征对术前MRI图像进行独立分析并讨论得出一致结论。
LI-RADS v2018特征：肿瘤大小、流出征象、非边缘动脉期高强化、强化包膜、晕状强化，瘤内含脂、马赛克征、结中结征象、瘤内出血、弥散受限、T2轻-中度高信号。
非LI-RADS特征：ITM、HBP PLSI、瘤内坏死。
图1 纳入和排除标准流程图
研究结果
➣ 两组患者基本特征均无显著差异。120例入组患者中，33例（27.5%）为PD-L1表达阳性，其中训练组有23例（23/84, 27.4%），测试组有10例（10/36, 27.8%）。62例（51.7%）为高密度CD8肿瘤淋巴细胞浸润，其中训练组有43例（43/84, 51.2%），测试组有19例（19/36, 52.8%）。28例（23.3%）同时为PD-L1表达阳性及高密度CD8细胞浸润，其中训练组有20例（20/84, 23.8%），测试组8例（8/36, 22.2%）。
➣ CD8肿瘤淋巴细胞密度在PD-L1阳性患者中显著高于PD-L1阴性患者（P<0.001）
➣ 对于所有征象，两观察者间具有较高的一致性（κ值0.7~1.0）
➣ ITM和PLSI是PD-L1表达的阳性预测因子。
● 单因素分析中，与PD-L1 表达阴性的HCC相比，PD-L1表达阳性的HCC中ITM（P=0.009）、瘤内坏死（P=0.057）、瘤内含脂（P= 0.158）和PLSI（P<0.001）更常见。
● 多因素分析中，只有ITM（OR 11.908; 95% CI 1.924~73.711; P=0.008） 和 HBP PLSI（OR 13.835; 95% CI 3.190~59.995; P <0.001）是独立预测因素。
● ITM的AUC、敏感性、特异性、准确性、阳性似然比（PLR）和阴性似然比（NLR）值分别为0.670、91.3%、42.6%、56.0%、0.60和0.08，而肝胆期 PLSI的AUC、敏感性、特异性、准确性、PLR和NLR值分别为0.712、52.2%、90.2%、79.8%、2.00和0.20（表1）。
表1 训练组中预测HCC患者PD-L1阳性表达的单因素和多因素分析
➣ AEC(无包膜强化)和PLSI是高密度CD8细胞浸润的预测因子。
● 单因素分析中，HCC中高密度CD8细胞浸润与无包膜强化（AEC, P=0.001）、ITM （P=0.048）、HBP PLSI （P=0.050）、晕状强化（P=0.190）和马赛克征（P=0.132）相关。
● 多因素分析中，只有AEC（OR 5.5; 95% CI 1.948~15.796; P=0.001）和HBP PLSI（OR 4.4; 95% CI 1.203~16.227; P=0.025）是高密度CD8细胞浸润的独立影响因素。
● AEC的AUC、敏感性、特异性、准确性、PLR和NLR值分别为0.691、67.4%、70.7%、69.0%、2.42和0.48，而HBP PLSI的AUC、敏感性、 特异性、准确性、PLR和NLR值分别为0.590、30.2%、87.8%、58.3%、2.60和0.83（表2）。
表2 训练组中预测HCC患者高密度CD8细胞浸润的单因素和多因素分析
➣ PLSI和ITM是与PD-L1表达阳性和高密度CD8细胞浸润组合的相关预测因子。
● 单因素分析中，PD-L1表达阳性与高密度CD8细胞浸润组合与三个预测因子相关：ITM（P=0.021）、HBP PLSI（P<0.001）和坏死（P=0.012）。
● 多因素分析中，只有ITM （OR 7.8； 95% CI 1.334~45.717；P=0.023） 和 HBP PLSI（OR 10.2；95% CI 2.636 ~39.087；P = 0.001）与PD-L1阳性和高密度CD8细胞组合具有相关性。
● ITM的AUC、敏感性、特异性、准确性、PLR和NLR值分别为0.653、90.0%、40.6%、52.4%、0.47和0.08，而HBP PLSI的AUC、敏感性、特异性、准确性、PLR和NLR 值分别为0.720、55.0%、89.1%、81.0%、1.57和0.16（表3）。
表3 训练组中预测肝HCC患者PD-L1表达阳性和高密度CD8细胞浸润组合的单因素和多因素分析
➣ 基于MRI特征建立的模型可较好地预测PD-L1表达阳性，高密度CD8细胞浸润，及二者组合。在训练组和测试组中，预测PD-L1阳性率的敏感性、特异性、准确性和AUC值分别为52.2%和66.7%、90.2%和85.2%、79.8%和80.6%、0.810和0.809。在训练组和测试组中，预测高密度CD8细胞浸润的敏感性、特异性、准确性和AUC值分别为81.4%和88.9%、61.0%和55.6%、71.4%和72.2%，以及0.740和0.728。在训练组和测试组中，预测PD-L1阳性和高密度CD8细胞浸润组合的敏感性、特异性、准确性和AUC值在分别为55.0%和71.4%、89.1%和89.7%、81.0%和86.1%、0.809和0.874（图2）。
图2 根据MRI特征构建的模型对于评估PD-L1表达阳性、高密度CD8细胞浸润以及两者组合的敏感性（%）、特异性（%）、准确性（%）的效能检测
➣ 治疗前的钆塞酸二钠增强MRI有助于选择更可能对免疫治疗有效的HCC候选人。在接受抗PD-1抑制剂治疗并接受钆塞酸二钠增强MRI扫描的34例晚期HCC患者中（独立验证组）：6例患者对免疫治疗有效，3/6例（50.0%）和4/6例（66.7%）分别在治疗前MRI图像上表现出 PHA（PLSI+AEC）和PHI（PLSI+ITM）特征。28例对免疫治疗无效的患者中，仅1/28例（3.6%）和2/28例（7.1%）患者表现出PHA和PHI的特征。免疫治疗的客观反应率与PHI（P=0.004）和PHA（P=0.012）具有相关性。
研究结论
➣ 钆塞酸二钠增强MRI具有在治疗前预测HCC患者的免疫状态及免疫治疗效果的潜力，并可帮助制定最佳的免疫治疗策略。
➣ 在术前钆塞酸二钠增强MRI图像中，AEC和HBP PLSI可独立预测肝癌患者高密度CD8肿瘤淋巴细胞浸润；HBP PLSI和ITM可独立预测PD-L1阳性表达，以及高密度CD8淋巴细胞浸润和PD-L1阳性表达两者的组合。
参考文献：
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专家点评
王劲 教授：
原发性肝癌（HCC）起病隐匿，恶性程度高，易发生进展及转移，往往发现疾病时已是肝癌中晚期。根据最新的世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）数据显示，2020年我国HCC新发病例41万余例，而死亡人数逼近发病人数，高达39万余例，成为我国第四大常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的第二大原因[1]。较长一段时间内，对于HCC的主要治疗手段包括手术、肝移植、放化疗、介入、消融治疗及靶向治疗等，但传统治疗方法疗效有限。近年来，随着对HCC的免疫系统研究逐步深入，以程序性死亡蛋白-1（PD-1）/程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）为靶点免疫治疗已然成为一种新兴的治疗手段。免疫治疗能够提高HCC患者的总生存期和无进展生存期[2-4]，给HCC患者带来了新的希望。然而，仅有不到20%的患者对免疫治疗有效[3-4]。因此，如何能够在治疗前对患者免疫状态进行评估，以识别对免疫治疗获益的患者，成为HCC免疫治疗的关键步骤之一。
既往研究显示，PD-L1在肿瘤细胞中的表达和CD8肿瘤淋巴细胞浸润状态被认为是可以预测并筛选免疫治疗候选者的组织生物学标志物[5]，有助于对抗肿瘤免疫治疗有效的患者进行治疗前识别，对于治疗和预后都至关重要。基于CT或MRI特征以评估免疫浸润或PD-L1表达的影像学方法过去已有报道，其中MRI的软组织分辨率高，可以提供多项参数来反应患者的病理生理学信息，而肝特异性对比剂钆塞酸二钠在HCC诊断及预后方面的价值已被临床广泛认可。
基于此，我们团队设计并开展了一项单中心回顾性研究，纳入120例HCC患者，分为训练组和测试组，采用钆塞酸二钠增强MRI的LI-RADS和非LI-RADS影像特征，建立模型以评估CD8肿瘤淋巴细胞浸润密度和PD-L1表达。另外，研究还纳入34例接受了抗PD-1单抗治疗的患者作为独立验证组，来分析影像学特征与免疫治疗客观反应率间的相关性。
研究发现，一种LI-RADS特征（包膜强化）的缺失和两种非LI-RADS影像学特征（不规则的肿瘤边缘和肝胆期瘤周低信号）的存在与高密度CD8细胞浸润或PD-L1阳性相关。其中，肝胆期瘤周低信号（PLSI on HBP）和无强化包膜（AEC）是高密度CD8细胞浸润的预测因子，而PLSI on HBP和不规则肿瘤边缘（ITM）在PD-L1阳性的患者，以及同时存在高密度CD8细胞浸润和PD-L1阳性的患者中更为常见。在独立验证组中，结果显示治疗前MRI表现为PLSI on HBP和AEC （PHA）或PLSI on HBP和ITM（PHI）的患者更能获益于免疫治疗。因此，治疗前钆塞酸增强MRI能够识别处于免疫激活状态的HCC患者，并能潜在的帮助选择更可能对免疫治疗有效的患者。
尽管结果令人欣慰，但研究也具有一定局限性。首先，单中心回顾性研究可能存在一定程度的选择性偏倚，同时为了确保术后有足够的肿瘤标本检测PD-L1表达和CD8细胞密度，研究仅纳入接受手术的患者。其次，研究样本量较小，未来仍需要更大样本和更长观察时间的研究来验证，可以进一步探讨接受免疫治疗后患者的MRI特征与PD-L1表达或CD8细胞浸润之间的关系。免疫检查点抑制剂的临床应用对HCC的治疗发展具有重要的意义。影像学作为一种无创的方式，具有筛选出更能获益于免疫治疗的人群的潜力。未来需要更多的研究，从不同角度，如疗效的评估和生存获益等，来促进HCC免疫治疗的发展。
参考文献：
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[3] Zhu AX, Finn RS, Edeline J, Cattan S, Ogasawara S, Palmer D, Verslype C, Zagonel V, Fartoux L, Vogel A, Sarker D, Verset G, Chan SL, Knox J, Daniele B, Webber AL, Ebbinghaus SW, Ma J, Siegel AB, Cheng AL, Kudo M, KEYNOTE-224 investigators (2018) Pembrolizumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma previously treated with sorafenib (KEYNOTE-224): a non-randomised, open-label phase 2 trial. Lancet Oncol 19(7):940–952. https:// doi. org/ 10. 1016/ S1470- 2045(18) 30351-6
[4] El-Khoueiry AB, Sangro B, Yau T, Crocenzi TS, Kudo M, Hsu C, Kim TY, Choo SP, Trojan J, Rd WTH, Meyer T, Kang YK, Yeo W, Chopra A, Anderson J, Dela Cruz C, Lang L, Neely J, Tang H, Dastani HB, Melero I (2017) Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): an open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial. Lancet 389(10088):2492–2502. https:// doi. org/ 10. 1016/S0140- 6736(17) 31046-2
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