Nature子刊：科学家成功分化出人类心脏形成类器官
心脏是在胚胎中形成的第一个功能器官。它起源于内脏的中胚层，内脏的中胚层是在胃造瘘过程中从原始条纹中出现的。心脏前中胚层规范后，后代在胚胎中线的每一侧形成双侧心脏形成区域，与发育中的前肠内胚层13紧密接近并感应交换。心脏形成区域的细胞跨过中线延伸并融合到心管中，该心管由两层组成，即心肌层和心内膜。后来，心管经历循环，这将定位未来的心腔。心脏的最外层，即心外膜，源自称为“前皮膜”的祖细胞群，并产生心脏成纤维细胞和平滑肌细胞。人类多能干细胞（hPSC），包括胚胎干细胞（hESCs）和诱导型PSC（hiPSCs），具有自组织成三维（3D）结构的能力，这种结构称为类器官，类似于体外的类胚胎组织模式。虽然类器官模型已被用于广泛的范围的组织中描述的，但是在心血管领域进展有限。
基于此，来自莱布尼茨生物技术和人工器官研究实验室（LEBAO）的Robert Zweigerdt教授，带领团队通过将人类多能干细胞聚集体嵌入Matrigel中，然后通过小分子的双相WNT途径调控的定向心脏分化，来生成复杂的，高度结构化的三维心脏形成类器官（HFO）。相关研究成果以“Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development”为题，在线发表在《Nature Biotechnology》杂志上。
研究人员通过分化嵌入基质胶的hPSC聚集体形成稳定的HFO。自由浮动HPSC聚集体有效地分化成在悬浮培养中高纯度的心肌细胞在响应于经典Wnt途径调制由小分子如CHIR99021（CHIR; WNT通路活化剂）和IWP2（WNT通路抑制剂）。对于HFO的形成，研究人员应用了等效的协议，但是使用了嵌入到Matrigel中的单个hPSC聚集体，其大小已定义（基于分化日减去4（d-4）时聚集体形成所播种的细胞数量）。在测试的四个不同起始细胞数（500、3,500、5,000和10,000个细胞）中，HFO的形成仅以5,000个细胞成功。
研究人员还发现NKX2.5–eGFP的表达表明了ML（和部分OL）的致心肌性质，通过对心肌标志物肌球蛋白重链（MHC）和心肌肌钙蛋白T的免疫荧光（IF）染色证实（cTnT），其中连续的正面部分加强了ML背面覆盖IC的观察。第二个心脏场（SHF）标记ISL1从d7到d13的HFO的流式细胞术染色显示d7上〜77％的NKX2.5–eGFP / ISL1双阳性SHF样细胞，在d13上降至〜25％。相比之下，我们没有检测到代表第一个心脏区域（FHF）的任何TBX5阳性细胞，这表明在氢氟烯烃心肌细胞表现出SHF样表型（预期为WNT-定向分化）。根据它们的动作电位特征，进行了膜片钳以进一步确定HFO衍生的NKX2.5–eGFP阳性心肌细胞的心脏表型。该分析表明，除一些非典型动作电位外，次要细胞群（5.7％）显示出心房样表型，而大多数（75.5％）被分配为心室样表型（扩展数据图2c-f）。对于后者，其他动作电位特性如低上冲程速度建议未成熟心室样表型，在一致性施加化学WNT调制之前工作。通常在d7–d10观察到HFO收缩的开始。HFO通过钙成像显示出明显的收缩模式：通常会发现圆形的跳动模式，但是在单个HFO中，观察到了从不同的起始点开始的波前状传播。
为了更详细地探讨HFO中组织的身份，研究人员将单细胞RNA测序（scRNA-seq）应用于两个HFO。两个样本的t分布随机邻居嵌入（t-SNE）图的覆盖图显示了相同位置的细胞群，从而证实了各个HFO中组织形成的稳健性）。自动聚类揭示了七个聚类，其中一个显示了代表死细胞的线粒体基因的显着过表达。其他六个簇显示群体特异性表达模式，证实了微阵列分析和IF染色结果。由这些簇表达的关键基因的t-SNE图在图4c和扩展数据图4c中给出。最大的簇（约占所有活细胞的38％）的特征在于众多心脏基因，包括TNNT2（cTnT），MYH6（MHCα）和NKX2.5。ISL1在该簇中的表达较低，这与扩展数据图2b中所示的d13 HFO的流式细胞仪数据一致。在该簇中还发现了TBX5和HCN4的表达。这些标记都与FHF了初步联系。
综上所述，该研究团队在此描述了一种诱导自组织hPSC衍生HFO的可靠方法，该方法由内衬心内膜样细胞，被ST样细胞包围，由不同的AFE和PFE组织构成，并被血管网络覆盖的ML组成。HFOs在发育中的胚胎中显示出与早期心脏和前肠胶原蛋白的形态相似性，其中在心脏前中胚层规格确定后，心脏祖细胞形成了靠近发育中的AFE 13的心脏形成区域。来自AFE的信号介导来自中胚层的心内膜前体细胞的分层，从而使心内膜细胞位于发育中的心肌和AFE之间。同样，在HFO中，心内膜样细胞在ML和IC（包含AFE组织）之间形成衬里，尽管需要进一步评估以明确证明这些细胞代表心内膜。
参考文献
1、Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021 Feb 8. doi: 10.1038/s41587-021-00815-9. Epub ahead of print. PMID: 33558697.
2、Múnera JO, Wells JM. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods Mol Biol. 2017;1597:167-177. doi: 10.1007/978-1-4939-6949-4_12. PMID: 28361317.
