铁死亡的详细介绍
“铁死亡”是一种新兴的细胞死亡方式，在2012年被正式定义后，关于铁死亡的研究如雨后春笋般涌现出来。而2021年初发表在Nature Reviews Molecular Cell Biology上的一篇综述“Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease”，从铁死亡的发展史入手，阐述了铁死亡的调控机制以及与相关疾病的联系。下面，跟着小编去深入了解关于铁死亡的这些事儿吧！
摘要
自2012年“铁死亡”一词被创造以来，对它的研究在过去几年中呈指数增长。铁死亡是铁依赖性的磷脂过氧化作用驱动的一种独特的细胞死亡方式，受到多种细胞代谢途径的调控，其中包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性和氨基酸、脂质、糖的代谢，以及各种与疾病相关的信号途径。研究发现许多器官损伤和退行性病变是由铁死亡引起的。有趣的是，具有多重药物抗药性的癌细胞，尤其是处于间充质状态且易于转移的肿瘤细胞，非常容易发生铁死亡。因此，通过对诱导和抑制铁死亡对其进行药理调节，在治疗耐药性癌症、缺血性器官损伤和其他与脂质过氧化密切相关的退行性疾病上具有巨大的潜力。在本篇综述中，我们总结了当前对于铁死亡分子机制和调控网络的研究，铁死亡在肿瘤抑制和免疫监控中的潜在生理功能和病理作用，以及其靶向治疗潜能。更重要的是，正如其他所有快速发展的研究领域一样，在铁死亡的研究中，错误的观念和不恰当的实验方法也带来了巨大的挑战。因此，本综述也旨在探讨这些问题，并为铁死亡研究提供可重复且可靠的实用性指南。最后，本文也讨论了今后对于铁死亡研究的主要关注点和迫切需要解决的问题。
正文
虽然铁死亡这个名词在2012年才被提出，但很久以前就已经观察到了某些特殊形式的或者在某些方面上类似铁死亡的细胞死亡。例如，在20世纪中期的新陈代谢研究中，发现在神经细胞中存在一种氧化应激诱导的细胞死亡方式，称为氧化凋亡（oxytosis）。Harry Eagle在20世纪50和60年代对我们现在认为是类似于铁死亡的细胞死亡方式进行研究，做出了开创性工作，发现剥夺半胱氨酸会导致细胞死亡，而内源性合成半胱氨酸会使细胞对这种死亡方式产生抵抗力。现在，我们已经知道，半胱氨酸是生物合成还原型谷胱甘肽（GSH）的限速物质。GSH是哺乳动物细胞中最丰富的还原剂，对铁硫簇的生物发生非常重要，同时也是包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）和谷胱甘肽- s -转移酶在内的多种酶的辅助因子。为了维持GSH的合成，微环境中的半胱氨酸可以通过中性氨基酸转运体进入细胞，或以半胱氨酸的氧化形式（胱氨酸）通过system Xc-胱氨酸/谷氨酸反向转运体 （一个跨膜蛋白复合物，包含 SLC7A11和SLC3A2亚基；在本文中称为system Xc-）被细胞吸收，另外，也可以通过蛋氨酸和葡萄糖在转硫途径中合成半胱氨酸。维持GSH合成、促进system Xc-或GPX4活性被证明可以在不同氧化应激条件下，特别是导致硫醇缺乏的情况下保护细胞免受死亡，提示这些早期研究和铁死亡的相关性。
传统上，细胞的死亡过程被认为是被动的和不受控制的——直到在1970年间发现了程序性细胞死亡的第一种形式：细胞凋亡，其在发育过程中受到程序性调控。其他更广泛的被称为细胞死亡程序的可控细胞死亡不一定与发育过程相关，但都受到各种分子机制的调控。我们现在知道铁死亡也符合以上可控细胞死亡的标准：铁死亡由致命的脂质过氧化作用驱动，是细胞代谢和氧化还原平衡失衡的结果，并可以通过药物或遗传手段直接阻断脂质过氧化或耗尽细胞内的铁来阻止其发生。
尽管如此，铁死亡研究领域的许多方面仍处于起步阶段，近几年才由氨基酸和脂质代谢、铁稳态、氧化还原和硒生物学以及细胞死亡等相关领域合并而成。关于铁死亡的研究论文发表数量呈指数增长，因此需要对最近的研究进展进行全面的、批判性的审视，以便为不同领域的研究人员明确围绕这个主题的关键发现、问题和挑战。在此，我们将深入分析铁死亡机制和铁死亡调控过程，以及它潜在的生理功能和在疾病治疗中的作用。我们将讨论该领域关键性的问题和面临的挑战，并对铁死亡的研究提供切实可行的实验建议。
铁死亡调控机制
近年来，人们对铁死亡机制的理解突飞猛进。随着system Xc-（胱氨酸/谷氨酸反向转运体）-GSH-GPX4通路在抑制铁死亡中的作用被发现，目前已确定磷脂氢过氧化物（PLOOHs，一种基于脂质的ROS形式）是铁死亡的执行者（图2）。最近又发现了GPX4非依赖性的铁死亡监控通路。此外，在铁死亡框架下，PLOOH的合成机制，特别是PUFAs（多不饱和脂肪酸，PLOOHs的前体物质）的合成与活化也已被广泛研究。重要的是，所有这些研究最终都汇集到细胞代谢上，揭示出铁死亡和代谢途径之间存在密切联系。
FDFT1：法尼基二磷酸法尼基转移酶1
GCH1：GTP环化水解酶1
LOX：脂加氧酶
LPCAT3：溶血卵磷脂酰基转移酶3
PLOO·：磷脂氢过氧化物自由基
POR：细胞色素P450氧化还原酶
PUFA：多不饱和脂肪酸
PUFA-PL：含多不饱和脂肪酸链的磷脂
GPX4的关键作用
为寻找新的抗癌小分子，Stockwell研究组从2001年开始进行了一项高通量筛选，并在2003年发表了研究结果，报道了一系列复合物，这些复合物能够诱导细胞以一种独特的、区别于细胞凋亡和细胞坏死的方式死亡。反向筛选结果表明，多种铁离子螯合剂以及亲脂性自由基捕获型抗氧化剂可以抑制这种细胞死亡方式。由于铁在这种形式的细胞死亡中不可或缺，因此将这种细胞死亡形式命名为“Ferroptosis”即铁死亡。随后在对铁死亡机制的研究中确定了两个细胞组分，system Xc-和GPX4，利用化合物erastin和RSL3分别抑制它们的活性会诱导铁死亡发生。
磷脂过氧化的驱动因素
ETC：电子传递链
O2·2-：超氧阴离子
全基因组单倍体筛选以及基于CRISPR-Cas9的筛选发现了两种膜重塑酶，脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和 溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3），它们是铁死亡的重要驱动因子。ACSL4在铁死亡中发挥作用是因为它更倾向于催化长链PUFAs（包括花生四烯酸20：4和肾上腺酸22：4）和辅酶A连接。然后，这些产物会被多种LPCAT酶重新酯化为磷脂，从而增加细胞内长链PUFAs在脂质和膜结构中的掺入。ACSL4的基因缺失或药理学抑制会导致磷脂中长链PUFA尾向短链单不饱和脂肪酰基（MUFA）尾急剧转变。ACSL4缺陷细胞磷脂组中的这一关键变化使得它们能够在Gpx4敲除几个月后仍维持增殖，免受铁死亡影响。与上述机制类似，外源补充MUFAs，或硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）介导的细胞内MUFA生成，或ACSL3依赖的膜MUFAs富集已被报道能减少细胞受铁死亡的影响。值得注意的是，在三阴性乳腺癌的一个细胞亚群中，ACSL4的表达水平与它们对于铁死亡诱导剂的敏感性相关，且在耐药的间充质癌细胞和透明细胞性肾癌细胞中观察到了类似的相关性。因此，抑制ACSL4表达或许是细胞对铁死亡脱敏的主要机制，这一过程可能受到不同的信号通路调控，包括来源于细胞-细胞与细胞-胞外基质黏附的信号，这两种信号都经常在肿瘤发展中受到影响。相反，增加ACSL4表达或提高其活性，可能会在多种病理生理条件下促进铁死亡，例如缺血-再灌注损伤（一种与铁死亡诱导密切相关的病理状态）以及对辐射的响应。
毫无疑问，脂双层的不饱和程度是决定细胞对铁死亡敏感性的关键因素，但是对脂质过氧化实际上如何启动这一问题仍有许多不确定性和争议存在。将一对二烯烃分隔开的双烯丙基上的碳是已知最弱的C-H键之一，增加这种结构的数量会增加脂质自然氧化速率，例如含有PUFA的食物在环境氧张力下会腐败。可以想象，细胞自主产生的脂自由基或羟自由基（·OH，由于羟自由基反应速率近乎于扩散，它是最具有反应性的活性氧形式之一，一旦被生成，可以攻击周边大部分有机分子）可以启动不依赖于酶促反应的脂质过氧化，而这一过程可由铁作为催化剂的Fenton反应催化（图3）。
某些脂加氧酶（LOXs，非血红素依赖性的靶向PUFAs的双加氧酶），能够直接氧化生物膜中的PUFAs及含PUFA的脂质，提示LOXs可能介导铁死亡的诱导过程。已有一些结果支持这一可能性，如一些LOX的药理学抑制剂能够抑制铁死亡，敲除Alox15或应用LOX抑制剂黄岑素（baicalein）可以保护小鼠免受缺血性脑损伤。然而，在Gpx4敲除小鼠中敲除Alox15并不能在小鼠成纤维细胞中保护细胞免受铁死亡，也不能防止急性缺血性肾损伤或降低其致死率，此外，也不能在T细胞特异性敲除Gpx4小鼠中恢复铁死亡导致的CD8+T细胞数量下降。然而值得注意的是，LOXs主要与半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡相关，而非GPX4缺失诱导的铁死亡，因此，有必要利用不同的模型进一步剖析LOXs在铁死亡中发挥的作用。这些结果表明，在ALOX15活性缺失后可能有替代机制进行了补偿，LOXs可能只与某些特定条件下的铁死亡相关，某些频繁使用的 “LOX特异性”抑制剂可能作为自由基捕获型抗氧化剂发挥了非特异性活性，因此能够抑止铁死亡。事实上，一项最近的研究表明常用的LOX抑制剂同时具有捕捉自由基的抗氧化活性，从而对通常认为的LOXs在铁死亡中的作用提出了挑战。此外，对人类所有LOX同工酶活性广泛下调未能阻止RSL3诱导的铁死亡，却显著抑制了erastin诱导的铁死亡，而这可能由于erastin处理与LOX酶激活相关。因此，在大多数情况下LOXs可能不是铁死亡的关键驱动因素，但在某些情况下可能有助于铁死亡的启动和发展。与此观点一致，Alox15或者Alox12的缺失分别在一些神经退行性或者癌症抑制小鼠模型中表现出保护作用。但是，必须强调的是，这些酶在免疫系统中本身发挥着重要的生理作用，通过产生促炎和抗炎分子直接调节（神经）炎症过程和肿瘤微环境，因此，它们缺失所带来的有益作用可能并不一定与铁死亡直接相关。先前的发现也支持这一观点：GPX4可以通过“胞内过氧化物度”（cellular peroxide tone，即细胞内持续的低浓度过氧化物）调控LOXs以及环氧酶的活性，因为这两种酶都需要通过脂质氢过氧化物氧化它们的铁，以捕获分子氧并将其掺入到PUFAs中。值得注意的是，ALOX12已经被报道对于过氧化物引发的p53依赖性铁死亡是必要的，这种铁死亡形式似乎不需要ACSL4参与，是一种独特的铁死亡形式。这表明p53-ALOX12诱导的铁死亡可能通过其他脂质介导，而与GPX4缺失或半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡无关。此外，磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（PEBP1）也已被报道会与某些LOXs形成复合物，改变它们对于PUFA-PLs的底物特异性。
有趣的是，尽管细菌的膜中普遍缺乏PUFAs，但是绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）能够表达一种分泌型脂氧合酶（PA-LOX）。这种酶可以在人红细胞膜中诱导脂质氧化，也能在人类支气管上皮细胞中诱导铁死亡。因此，囊性纤维化患者（小编注：这类患者更易发生绿脓杆菌感染）的磷脂酰乙醇胺中花生四烯酸氧化水平升高，而磷脂酰乙醇胺被报道是在铁死亡的细胞和组织中检测到的主要磷脂形式之一）。这种跨物种的铁死亡诱导机制耐人寻味，也值得进一步研究，以确定是否有其他低等生物利用了这种机制。
铁死亡中的铁
顾名思义，铁死亡依赖于铁。首先，非酶催化的、铁依赖的Fenton链式反应可能对于铁死亡是必要的：PLOOHs在GPX4被抑制时会持续存在更长时间，从而起始Fenton反应，使铁死亡标志物PLOOHs的含量迅速增加 （图3）。PLOOHs能够与亚铁离子和铁离子反应，分别产生自由基PLO·和PLOO·，引发破坏性的过氧化链式反应。应当指出的是，至少在这一铁催化链式反应的起始阶段，亚铁离子可能占据更主导的地位，因为铁离子在细胞中的溶解性相对较差，从而导致其生物利用度较低。此外，LOXs和POR发挥催化活性需要铁的参与，铁对于许多与细胞内ROS产生相关的基于氧化还原的代谢过程也是必不可少的。
由于铁在控制细胞生存和死亡中占据中心地位，细胞内的铁稳态受到精细调控也就不足为奇了。细胞内的铁稳态主要通过铁调节蛋白IRP1和IRP2调控，这两个蛋白参与了与细胞内铁储存/释放和摄入/排出相关基因的转录后调节。可以想象的到，许多胞内通路通过改变细胞内不稳定铁的含量改变细胞对于铁死亡的敏感性。例如，通过自噬降解铁储存蛋白铁蛋白（ferritin）提高细胞内铁的可利用度能够促进铁死亡（另见下一小节）。同样的，转铁蛋白（transferrin）和它的受体共同作用，通过促进细胞的铁输入促进铁死亡（另见下一小节）。相反，促进细胞内铁排出已被证明使细胞对铁死亡具有更强的抵抗力。此外，血红素加氧酶1（HO-1）介导的血红素降解会释放铁，因此也与铁死亡相关。然而一系列相互矛盾的数据显示HO-1即可促进铁死亡也可抑制铁死亡。
最近，对小鼠模型的体内研究进一步阐明了铁死亡中铁调控的作用。例如，敲除铁蛋白重链基因可能通过促进铁死亡导致心肌病。有趣的是，在小鼠肝细胞中特异性敲除转铁蛋白导致的表型出人意料：给敲除小鼠喂养富铁饮食增加了肝细胞的铁负荷（肝细胞是体内合成转铁蛋白的主要细胞类型），这导致小鼠更容易出现肝纤维化，而肝纤维化可以被亲脂性自由基捕获型抗氧化剂改善，表明铁死亡与这一肝脏病变相关。这项研究进一步表明转铁蛋白表达缺失后，肝细胞代偿性上调一种金属转运蛋白SLC39A14的表达，导致铁的过量摄入，从而导致铁死亡。
铁死亡中的代谢输入
铁、脂质、ROS和半胱氨酸/胱氨酸在铁死亡中的作用提示这种细胞死亡方式与细胞代谢之间存在密切联系。Jiang和同事们试图确定代谢如何影响细胞命运的研究揭开了铁死亡与细胞代谢之间复杂联系的面纱。自噬这一分解代谢过程是细胞在应对各种压力时的必要生存机制，但对于自噬是否能够促进细胞死亡，又如何促进细胞死亡（自噬性细胞死亡）已经争论了几十年。Jiang等人发现在氨基酸饥饿的条件下（一种引发强烈自噬的情况），自噬会促进一种快速的非凋亡、非坏死性细胞死亡，但仅在细胞处于血清充足的完全培养基的前提下。血清中携带铁的转铁蛋白和氨基酸谷氨酰胺对于这种形式的细胞死亡是必要的，从培养基中特异性去除胱氨酸则足以引发这种细胞死亡。考虑到铁依赖性以及胱氨酸在其中的保护作用，提示铁死亡是这种条件下细胞死亡的机制。在胱氨酸缺乏的情况下，自噬通过降解铁蛋白（也称为铁自噬）导致细胞内不稳定铁含量上升，从而使细胞对铁死亡敏感，诱导铁死亡（图4）。
ETC：电子传递链
谷氨酰胺代谢或谷氨酰胺分解对于胱氨酸缺乏诱导的铁死亡是必须的，从而将铁死亡与氧化代谢联系起来。谷氨酰胺一个关键的回补代谢物，能够为线粒体TCA循环（三羧酸循环）提供能量底物，从而增加线粒体呼吸率和ROS生成潜能。因此，线粒体的正常代谢功能似乎与铁死亡相关—这一结论随后通过多种药理学、细胞学和遗传学分析得到了验证（图4）。值得注意的是，早些时候线粒体已被证明是氧化凋亡（oxytosis）的活跃参与因素。除了线粒体外，植物细胞拥有另一个独特的细胞器-叶绿体，可以进行一连串的氧化还原合成代谢反应。由于在植物中已经发现依赖于铁和ROS的铁死亡，一个有趣的推测是，在植物中叶绿体也可能在铁死亡的调节中发挥重要作用。
基于这些发现，人们也提出了更多的假设和问题，例如：作为线粒体TCA循环的主要燃料，葡萄糖是否调控铁死亡？的确，葡萄糖饥饿近年来被发现可以抑制铁死亡。然而，从机制上讲，这一现象似乎主要由关键能量感受器AMPK所介导，而非通过TCA和线粒体呼吸调节（稍后详述），提示铁死亡与多种代谢因素相关，但目前对这一点的研究还不是很透彻。与此相关的问题是，如果谷氨酰胺仅仅通过维持线粒体呼吸来发挥促进铁死亡的作用，那么，为何细胞培养在富含葡萄糖的条件下时，这种培养条件是促进TCA活性并能保证高呼吸能力的，但此时胱氨酸缺乏诱导的铁死亡仍需要谷氨酰胺呢？另一个问题是铁死亡的基本原理，例如线粒体代谢是否通过产生特定的脂质前体促进PLOOH合成（TCA循环的中间产物可以促进脂质合成）或通过促进ROS产生（氧化代谢反应的天然副产物）促进铁死亡？已经有研究发现线粒体活性和谷氨酰胺分解对于半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡是至关重要的，但对于抑制GPX4诱导的铁死亡却并非必不可少，这为后一种可能性即线粒体代谢通过促进ROS产生促进铁死亡提供了更多的支持。
GPX4非依赖的监控途径
尽管半胱氨酸/胱氨酸-GSH-GPX4轴被认为是哺乳动物中对抗铁死亡的主要系统，全基因组筛查最近发现了GPX4非依赖的铁死亡监控机制。
第一种机制涉及铁死亡抑制蛋白1（FSP1,也被称为AIFM2）。AIFM1是FSP1的同源物，最初被认为像FSP1/AIF2一样促进凋亡，但现在发现AIFM1与线粒体膜间隙蛋白转运及正确折叠相关。此外，实际上FSP1缺乏实质性的促凋亡功能，但却具有保护细胞的功能，使细胞免于抑制GPX4或GPX4基因敲除诱导的铁死亡。FSP1被肉豆蔻酰化修饰，并且与包括细胞质膜、高尔基氏体和细胞核周结构在内的多种细胞膜结构相联系。突变FSP1的肉豆蔻酰修饰位点会使它丧失抗铁死亡功能。机制上讲，由于FSP1具有NADH：泛醌氧化还原酶活性，FSP1通过还原泛醌（或泛醌的不完全氧化产物半氢醌）产生泛醇，这能够直接减少脂质自由基，终止脂质自氧化反应，或者间接的通过促进氧化型α-生育酚自由基（维生素E，一种强大的天然抗氧化剂）再生，抑制脂质过氧化和铁死亡（图2b）。泛醌的这种保护作用揭开了一个长期存在的谜团，即为什么一些细胞和组织，如具有高代谢活性的肝细胞内，在线粒体外会存在大量泛醌，这与泛醌在线粒体电子传递链中的经典功能是不一致的。
在另一项研究中，GTP环水解酶1（GCH1）被报道可通过其代谢产物四氢生物喋呤（BH4）和二氢生物喋呤（BH2）抵抗铁死亡。BH4被证明可能通过双重机制（即作为自由基捕获型抗氧化剂或参与泛醌合成）保护含有两PUFA尾的磷脂免受氧化降解（图2c）。尽管GCH1在保护组织和器官免受铁死亡中的作用仍有待阐明，但已有基因敲除研究表明，Gch1在小鼠体内的缺失会导致小鼠在妊娠中期的心动过缓和胚胎死亡。
▼ 名词解释
1、脂质过氧化（Lipid peroxidation）：是一种脂质的氧化性破坏过程，在这个过程中,自由基从细胞膜上的多不饱和脂肪酸残基中获取电子，导致以碳为中心的脂质自由基形成。如果该过程没有被酶促反应或亲脂性抗氧化剂抑制，就会产生脂质过氧化连锁反应。
2、铁硫簇（Iron–sulfur clusters）：由铁和硫组成的小分子结构，通常被整合到酶和介导电子传递的蛋白复合物中。
3、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPXs）：是一类在结构上相关的酶家族，通常以谷胱甘肽作为电子供体，催化过氧化氢（H2O2）或其他过氧化物分别还原为水和醇。
4、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferases）：一类通过催化还原型谷胱甘肽（GSH）与外源物质（通过巯基）结合以帮助解毒的酶。
5、硫醇缺乏（Thiol deprivation）：一种以半胱氨酸缺乏为特征的细胞状态，会导致细胞内谷胱甘肽耗竭及内质网应激。
6、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）：指处在部分还原态的氧，例如过氧化氢、超氧化物、单线态氧和羟自由基，它们可能发生氧化反应并因此破坏包括脂质、蛋白质、DNA在内的细胞成分。
7、硒蛋白（Selenoprotein）：硒蛋白是指硒以硒半胱氨酸的形式在翻译过程中掺入蛋白质形成含硒蛋白，硒半胱氨酸通常构成蛋白质的活性部位，参与抗氧化反应。
8、自由基（Free radicals）：在外层轨道上有未配对电子的一类分子，如羟基自由基和过氧自由基，这类分子通常不稳定并具有高活性。
9、缺血再灌注损伤（Ischaemia–reperfusion）：血液流动受限和缺氧后，恢复血液供应和供氧，会导致氧自由基形成、细胞死亡以及组织损伤，例如缺血性心脏病和缺血性肾衰竭。
10、Fenton反应（Fenton reaction）：铁与过氧化氢（H2O2）之间的化学反应，会产生剧毒的自由基，进而引发脂质过氧化。
11、环加氧酶（Cyclooxygenases）：存在于哺乳动物中的酶家族，含有两种特定酶，通过催化花生四烯酸氧化产生前列腺素介导多种生理过程，如炎症、血管生成及疼痛等。
12、铁蛋白（Ferritin）：细胞中一种储铁蛋白质，可以结合并捕获细胞内铁离子形式的铁。
13、转铁蛋白（Transferrin）：转铁蛋白是通过受体介导的内吞作用将铁转运到细胞内的蛋白质。
14、回补代谢物（Anaplerotic metabolite）：在某些代谢途径中发挥补充功能的代谢物，例如谷氨酰胺通过生成α-酮戊二酸，补充三羧酸循环（TCA）中间代谢物的供给。
15、泛醌（Ubiquinone）：一种由甲羟戊酸途径产生的亲脂性代谢物（也称为辅酶Q10），其主要功能是在线粒体呼吸链中传递电子。
16、甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway）：一种可以产生胆固醇和泛醌等萜类衍生物的脂类合成途径。
17、异戊烯化修饰（Isopentenylation）：是一种转录后修饰，tRNA上的第37位碱基可发生异戊烯化修饰，形成N6-异戊烯腺苷（i6A）。