非肿瘤生信 + 临床样本 + Nomogram =7+文章
今天给大家分享一篇关于COPD（慢性阻塞性肺病）的文章"Identification of Inflammation-Related Biomarker Lp-PLA2 for Patients With COPD by Comprehensive Analysis（综合分析慢性阻塞性肺疾病患者炎症相关生物标志物PLA2）"。
文章是今年2月份发表在frontiers in immunology杂志上的，影响因子IF=5.08，即时IF=7.3。文章作者通过差异表达筛选出差异基因，再对差异基因进行富集分析，找出主要富集的通路；通过免疫浸润找出共有通路，再构建WGCNA网络，最终确定影响COPD关键基因，并基于临床数据构建nomogram模型。
差异表达以及富集分析
作者把患者分为COPD组和正常组，使用“limma”对两组患者进行差异分析，如图A、B所示。共鉴定出39个上调基因和313个下调基因，对这352个差异基因进行富集分析，GO富集结果表明，差异基因主要参与细胞骨架和细胞因子相关的生物过程(图C）。
GSEA富集通路如图所示（图D），这些通路确定了COPD的潜在生物标志物和参与COPD进展的异常信号通路。
差异表达基因分析和火山图
COPD患者的免疫浸润分析
富集分析结果表明，与正常吸烟组相比，COPD组患者免疫相关的通路得到了富集。为了探索COPD患者和正常吸烟者的免疫状况，对GSE76925数据集的肺组织转录组数据进行了分析。作者通过在线工具CIBERSORTx计算转录组中22中免疫细胞的比例，22种免疫细胞在GSE76925中的分布如图2A所示。
结果表明，患者T cells CD8、T cells follicular helper、T cells gamma delta和macrophages M0表达上调，而COPD组患者T cells CD4 memory activated、monocytes、和 eosinophils表达下调（图B）；接下来，作者分析了免疫浸润与临床特征的关系。
如图C所示，monocytes、T cells CD4 memory resting 与FEV1/FVC呈负相关；T cells CD8、macrophages M0与FVC1%预测值呈负相关(图D)。
COPD患者的免疫浸润分析
WGCNA关键模块的识别
为了确定与COPD患者临床特征相关的关键基因，用GSE76925数据集通过WGCNA进行共表达网络分析。从GSE76925数据集获得临床特征(年龄、性别、BMI、FEV1/FVC和FVC1%预测值)。作者将软阈值设置为3（R²=0.906）并将高度设置为0.25来建立参数，最终确定了8个模块（图A-C）。
通过模块特征基因值和临床特征之间的相关性来测量模块和临床特征之间的关联。数据通过热图可视化。图D-G中的结果显示，棕色模块与COPD(correlation= 0.36，P = 6E-06)、FEV1/FVC(correlation= 0.38，P = 1E-06)和预测的FVC1 %最接近(correlation= 0.4，P = 5E-07)。
加权共表达网络分析
关键基因的筛选和验证
因为棕色模块的相关性最高，作者选择了棕色模块和差异表达中共同上调和下调的10个差异基因（图A），包括HTR2B、CLECL1、FGG、CORIN、PLA2G7、BHLHE22、SPP1、TIMP4、TM4SF19和MMP9。
并将这10个基因用数据集GSE38974进行外部验证（图B），接下来，在GSE69818中验证了这10个基因与GOLD分期之间的关系(11名1期患者、41名2期患者、9名3期患者和9名4期患者)，如图C所示。随着分期的递增，PLA2G7和BHLHE22的表达水平显著递增。作者选择PLA2G7进行后续分析，因为它在两个独立的数据集上显示出显著的差异。
关键基因的选择和验证
PLA2G7的富集分析和验证
作者分析了PLA2G7与COPD患者临床特征的关系。如图A所示。为了阐明PLA2G7在COPD中的潜在调节机制，GSE76925数据集用于GSEA分析，根据PLA2G7的中位表达水平将COPD样本分组，如图B所示。作者发免疫相关的通路在高表达PLA2G7中显著富集，随后作者分析了免疫浸润与PLA2G7表达的关系。
如图C所示，PLA2G7与巨噬细胞具有显著相关性。为了研究PLA2G7在与COPD相关的其他组织中是否有差异表达，我们分析了一系列数据集。如图5D所示，鉴于PLA2G7表达水平与巨噬细胞之间的显著相关性，我们分析了支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺泡巨噬细胞PLA2G7表达的差异。如图E所示，PLA2G7可能通过调节巨噬细胞在免疫调节中发挥作用。
PLA2G7的富集分析和验证
临床样本中PLA2G7编码蛋白Lp-PLA2的验证
在临床样品中使用酶联免疫吸附法检测由PLA2G7基因编码的蛋白质的水平。Lp-PLA2由PLA2G7基因编码，是一种结合脂蛋白的血浆酶。从不吸烟者和正常吸烟者的血清Lp-PLA2浓度无显著差异。此外，从不吸烟者和正常吸烟者的血清脂蛋白-Lp-PLA2浓度明显低于慢性阻塞性肺病患者(图A)。
此外，Lp-PLA2的表达与GOLD分期相关(图B)；接下来，作者分析了Lp-PLA2的表达与COPD患者临床特征的关系。Lp-PLA2水平与肺功能的关系分析表明，Lp-PLA2水平与FEV1/ FVC呈负相关(r = -0.528，P < 0.001)(图C)。作者分析了LpPLA2水平与CAT和mMRC评分之间的关系。如图6D所示，Lp-PLA2水平与mMRC以及CAT评分显著正相关。
COPD患者血浆Lp-PLA2水平的临床价值
预测运动耐量受损的诺谟图的构建
作者结合传统的临床特征，如年龄、年级、FEV1/FVC、BMI、CAT评分和mMRC评分以及Lp-PLA2水平，构建了一个预测受损的列线图模型（图A），校准图证实了我们模型的预测性能(图B)。
为了证明列线图模型的临床优势，我们将单变量的ROC曲线与列线图曲线进行了比较，诺谟图模型的AUC值最高(图C)。最后用决策曲线分析(DCA）来证实研究结果。与单个临床变量相比，组合诺谟图模型显示6MWD <350 m预测的最高功效(图D)。这些方法证实了我们的诺谟图模型的临床实用性。
Nomogram模型的构建
小结
文章作者经过一系列的研究，最终确定Lp-AP2是影响COPD的潜在生物标志物，Lp-PLA2是一个十分具有前景的COPD患者的生物标志物，它适用于预测临床中较差的运动耐量指标。
来源：科研风暴
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