单细胞测序揭示小鼠皮肤炎症中多种免疫反应

文章信息

文章题目：Single-Cell Profiling Reveals Divergent, Globally Patterned Immune Responses in Murine Skin Inflammation
发表时间：2020年10月
期刊：iScience
DOI：https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101582

摘要

炎症反应异质性阻碍了在激活过程中对不同免疫细胞群的高分辨率解剖。我们使用imiquimod和oxazolone诱导炎症后，通过单细胞RNA测序来鉴定小鼠皮肤部位的免疫细胞。我们鉴定出13个CD45+亚群，这些亚群广泛代表功能最全的免疫细胞类型。Oxazolone在T细胞和抗原呈现细胞(APC)上普遍上调Jak2/Stat3的表达。Oxazolone还诱导IL4/IL13表达在新渗透的嗜碱粒细胞，诱导IL4ra和CcL24在Apc中表达。相比之下，imiquimod广泛上调节IL17/IL22和CcL4/CcL5。对单细胞炎症转录反应的比较分析认为，APC对oxazolone的反应受到细胞身份的严格限制，而imiquimod同时对多种APC发挥同样的诱导。这些通用的分子作用机制不仅对比系统层面的免疫反应，而且表明，与已知特征相比，可以推断出新的炎症源机制。

实验方法

测序样本

  1. 使用imiquimod（IMQ） 和oxazolone（OXA）处理 8周大，C57BL/6J小鼠
    OXA模拟小鼠接触性皮炎和过敏性皮炎
    IMQ：5%的浓度连续七天抹在双耳，最后一次涂抹24h后手机样本。
    OXA：OXA和对照组小鼠，在剃光的背部皮肤 应用50uL 3%溶于乙醇中的OXA。9天后，OXA治疗的小鼠在EtOH中接受10ul 0.5%OXA的刺激，每隔一天对两只耳朵的后腹和腹针（每只小鼠总共40uL）进行3次刺激，而对照小鼠则接受100%的EtOH治疗。在最后刺激后24小时收集了老鼠耳皮样本。
  2. 样本分为四组：
    OXA-C (oxazolone control),
    OXA (oxazolone),
    IMQ-C (imiquimod control),
    IMQ (imiquimod). 
    收集样本裂解为单细胞后，用CD45抗体正向分选细胞，10X Genomics做单细胞测序。

数据质控

CellRanger与基因组比对，seurat包处理后，保留细胞cells displaying > 300 genes/cell and < 4000 genes/cell, < 20% 线粒体基因表达。还剩52086个细胞。35,369来自OXA组(17,340细胞来自 OXA- 处理后鼠，18,029细胞对照组), 16,717来自IMQ组(7,427是 IMQ- 处理小鼠，9,245对照组) 。产生21个亚群后，去除角质细胞、fibroblast、内皮细胞、分裂中的细胞，后剩下13个亚群均为免疫细胞。

数据分析

1.细胞分群

免疫细胞总共分为13个亚群，每个群在两种药物处理的样本和对照组中都有。

2.传统抗原表位分类的validation

方法：Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing (CITE-seq)

作者使用了 细胞索引转录组和抗原决定簇测序，能够将多种基于抗体检测的蛋白标记物及数千个细胞的无偏差转录图谱同时测定，该方法比单独的单细胞测序数据能够得到更加详细的细胞表型特征。

结果发现，转录组和细胞表面蛋白定义的APC、朗格汉斯细胞、DETC、肥大细胞高度一致

3.两种药物处理产生的细胞种类差别

基本的细胞类型相似，但是每种细胞的丰度不一样。

由于细胞亚群只能作为给定总细胞群的比例进行评估，因此无法正式确定种群丰度的变化是否代表细胞类型的绝对增加数或其他主要细胞类型的相对减少。只能说看个大概。如下：macrophage (102% and 273% for OXA and IMQ, respectively), M/MdM (340% and 476%), mDC (133% and 147%), NK (2,087% and 44%), and neutrophil (1,643% and 555%) cells. Population shift decreases after oxazolone treatment include dermal gd T cells (87%), ILC2 (90%), and LC (65%), as well as decreases for DETC for both oxazolone (92%) and imiquimod (68%)

4. 两种药物处理带来的差异

图B，两种药物处理分别与其相应的对照组相比对。看每个cluster中，差异基因在两种药物处理中的不同。结果发现在imiquimod处理后，IL17/22，IFN-γ在多个cluster中都有上调。其中，IL17a, IL17f, and IL22 的上调主要集中在dγδT细胞群中。

oxazolone处理后， type 1 and type 2 细胞因子上调；其中几群细胞中IFN-应答性基因上调。大部分细胞群中，oxazolone上调 Jak2 、Stat3、IL4ra的表达, Oxazolone处理后的细胞中type 2 细胞因子转录本(IL4, IL6, IL13) ， CCR1 趋化因子配体(CcL6 and CcL9), 主要在M/B细胞(肥大细胞和嗜碱性细胞)中表达上升。

5. oxazolone处理后，浸润皮肤的嗜碱性细胞产生IL4和IL13; imiquimod处理并没有这样的效果

IL4和IL13的产生主要集中在M/B cluster；嗜碱性细胞主要集中在OXA处理的细胞中，其他三组都没有（图B）。OXA处理后浸润的嗜碱性细胞，不仅表达Mcpt8等标志性marker，还是IL4, IL6, and IL13的来源（图D）。

6. 相比较IMQ，OXA处理产生一种更保守的和CD45+细胞特征相关的泛转录应答

看药物处理对皮肤的影响是表现在 细胞类型的不同？还是不同细胞亚型的反应不同？作者自己开发一种算法，名为DiVNCE 。

DiVNCE，它定量地描述了刺激产生的离散表达，能够评估不同刺激在免疫细胞群中的分布。虽然OXA产生高度细胞类型特异性模式，但IMQ在T细胞中有不一样的响应，主要由多个、不同的干扰素相关程序组成（图B）。APC在应答两种药物刺激时比T细胞亚型表现出更大的可塑性。

总结

我们首次在单细胞水平上比较两种药物对皮肤的炎症反应，同时使用CITE测序技术，转录组和细胞表面蛋白定义的APC、朗格汉斯细胞、DETC、肥大细胞高度一致。该研究提出的 DiVNCE，可以一用。ARI 指标，该指标在统计学意义上量化了OXA的这种更大程度的分子反应。更细致的基于模式的匹配方法可能通过与现有化合物库的比较，快速评估新化学制剂的免疫后果。

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