转录组讲师带你读文献(5)-circRNAs-seq也是转录组哦
我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）
所以安排转录组讲师给大家做一下领读：
1 文章信息
标题：Circular RNA circNHSL1 promotes gastric cancer progression through the miR-1306-3p/SIX1/vimentin axis
杂志：Molecular Cancer（IF15.302）；Published: 22 August 2019
作者：Chen Huang（通讯）,上海交通大学医学院上海总医院普外科
摘要：
背景：越来越多的证据表明环状rna (circRNAs)在各种癌症的发生发展中发挥着重要作用。然而，circRNAs 在胃癌中的具体功能和潜在机制仍不清楚。
方法：通过RNA-seq分析筛选转移相关环状rna的表达谱。采用qRT-PCR检测胃癌组织中circNHSL1的水平及预后价值。通过体外细胞创伤愈合和transwell(迁移和侵袭)以及体内肿瘤发生和转移的检测来评价circNHSL1的功能。采用荧光素酶报告基因、RNA免疫沉淀(RIP)和拯救检测证实circNHSL1、miR-1306-3p和SIX1之间的相互作用。Vimentin作为间质标记物，在多种癌症中促进侵袭和转移已被广泛接受。利用荧光素酶报告基因法测定SIX1对波形蛋白的调控作用。此外，我们还进行了原位杂交(ISH)检测miR-1306-3p的水平和预后价值。
结果：我们发现circNHSL1水平在胃癌中显著上调，与胃癌患者的临床病理特征及不良预后呈正相关。在功能上，circNHSL1促进细胞迁移和侵袭，以及体内肿瘤发生和转移。机制上，circNHSL1作为miR-1306-3p海绵，减轻miR 1306-3p对其靶点SIX1的抑制作用。此外，SIX1通过直接结合Vimentin的启动子区域，在转录水平上增强了Vimentin的表达，从而促进了细胞的迁移和侵袭。此外，miR-1306-3p在胃癌中下调，与胃癌的病理特征及不良预后负相关。
结论：CircNHSL1通过miR-1306-3p/SIX1/Vimentin轴促进胃癌进展，可能作为一种新的诊断标志物和治疗胃癌患者的靶点。
关键词：CircNHSL1, miR-1306-3p, SIX1, Vimentin, Metastasis, Gastric cancer
2 数据和方法
转录组的标准分析，比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；
解读GEO数据存放规律及下载，一文就够 解读SRA数据库规律一文就够 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够 GSEA分析一文就够（单机版+R语言版） 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的 差异分析得到的结果注释一文就够
3 结果
1 CircNHSL1在胃癌组织中表达上调，与胃癌进展及不良预后相关
找到38个差异表达circRNA：37个上调，1个下调
circNHSL1位于top10，circBase 中叫hsa_circ_0006835，来源基因chr6: 138,743,180–138,893,726，NHSL1。
circRNA的形成和来源图：
此外，circNHSL1在胃癌细胞胞浆中高度稳定，提示其有可能成为一种合适的诊断或预后标志物。circNHSL1的环状结构来源于反向剪接
2 CircNHSL1在体外促进胃癌细胞的迁移和侵袭
靶向沉默细胞实验证明。
3 CircNHSL1通过SIX1促进胃癌的进展
为了找到circNHSL1的表达正相关的基因，对以上3个无转移的胃癌组织和2个有转移的胃癌组织的circRNA进行RNA-seq检测。锁定The top 10 up-regulated genes，发现CircNHSL1的沉默可以显著降低MAP4K4 and SIX1的表达。circNHSL1的上调AMOT and SIX1的表达显著增加。
因此，circNHSL1的表达与SIX1的表达正相关。
验证这个正表达相关性：
group1：57对癌与癌旁配对的胃癌石蜡包埋组织。
group2：93对癌与癌旁配对的胃癌新鲜冷冻组织。
测序，采用的qRT-PCR，内参：GAPDH or U6 were used as internal controls for circRNA, mRNA or miRNA
93 paired gastric cancer tissues 中的61 paired gastric cancer tissues组织进行实验。验证结果如下：
4 SIX1通过转录调节vimentin的表达，促进胃癌的进展
作为同源箱基因家族的转录因子，SIX1可能在转录水平上调控靶基因的表达，从而发挥生物学功能。
vimentin上有两个SIX1的结合位点。
在61对样本中，这两个基因的表达正相关，如下图。
后面通过实验证明：SIX1通过在转录水平上积极调节Vimentin的表达，从而促进胃癌的进展
5 CircNHSL1作为miR-1306-3p的miRNA海绵
我们研究了circNHSL1是否通过吸附miRNAs促进胃癌进展。
首先，找到可能靶向circNHSL1的miRNA，SIX1的上游miRNA。结果表明，circNHSL1和SIX1共享具有较高的miR-1306-3p的microRNA响应元件(MREs)。
然后在以上61对胃癌组织和匹配正常组织中检测miR-1306-3p的水平，结果显示miR-1306-3p在80.33%(49/61)胃癌组织中较正常胃癌组织显著下调。
又是各种实验数据证明：这些数据表明circNHSL1在胃癌中起着miR-1306-3p海绵的作用
6 MiR-1306-3p逆转circNHSL1促进胃癌进展的能力
为了探究circNHSL1是否通过海绵化miR-1306-3p来发挥其生物学功能，我们在circNHSL1异位表达的基础上，对miR-1306-3p进行了上调或下调实验。
然后实验证明：circNHSL1通过浸润miR-1306-3p促进胃癌进展。
7 MiR-1306-3p在胃癌组织中下调，与临床病理特征及预后负相关
关于miR-1306-3p的研究报道较少，对miR-1306-3p在癌症中的表达水平、功能和作用尚未深入研究。因此，miR-1306-3p尚未被理解。
数据：在本研究中，我们使用另一组胃癌组织(一个TMA，包括54个成对的胃癌组织和匹配的正常组织)在ISH中检测miR-1306-3p的水平。ISH测得miRNA得表达。
结果表明，在61对以上新鲜冷冻胃癌组织中，miR-1306-3p在正常胃癌组织中的表达水平明显高于胃癌组织，与qRT-PCR结果一致。
同时，在临床因素方面的分析显示如下：
在stageII，M0和G1期，T2+T3中表达更高。
低表达与OS短，DFS短相关。
8 SIX1是miR-1306-3p的直接靶点
根据TargetScan数据库，SIX1 mRNA中含有miR-1306 3p的MRE，说明miR-1306-3p可能直接靶向SIX1。
在61 paired gastric cancer tissues样本中：miR-1306-3p and SIX1的表达负相关。
这些数据表明，miR-1306-3p通过直接与SIX1 mRNA的3 ' -UTR结合而抑制了SIX1的表达
9 MiR-1306-3p通过抑制SIX1表达抑制胃癌进展
考虑到circNHSL1和SIX1促进胃癌进展的作用，我们检测了miR-1306-3p对胃癌细胞迁移和侵袭的作用。结果表明，miR-1306-3p模拟物抑制了细胞的迁移、迁移和侵袭。
综上所述，miR-1306-3p通过抑制SIX1的表达而抑制胃癌的进展。
10 CircNHSL1在体内促进胃癌细胞的生长和转移
此部分做实验验证了circNHSL1在体内的生物学作用。
4 总结
文章中选择某个circRNA做什么研究直接用的top 1，不知道是巧合还是真的top几就可以发掘出这么多东西来。
也算是单基因研究的比较好的一个文章思路例子吧。
就是很多实验，非常多的实验。