锦旗研发︱通过调节肠道淋巴节的Treg与T17细胞与血液中的代谢物、短链脂肪酸CCFM1074改善类...
类风湿性关节炎，又被称为“不死的癌症”，特点为慢性关节滑膜炎症、血管翳形成。无法被治愈，随着损害的发展，最终会出现关节残疾，严重影响日常生活。截止2019年，全球类风湿性关节炎患者1220万例，中国占比近50%，临床未缓解病人占比80%。类风湿性关节炎病因复杂，目前治疗方式仍处于探索阶段。如何延缓类风湿性关节炎发展进程，缓解类风湿性关节炎症状，是我们研究的重要课题。
实验意义
研究已知资讯
类风湿性关节炎是一种慢性自体免疫疾病，造成的可能原因有许多种，包含有自体免疫失衡、遗传、肥胖、吸烟、微生物感染与环境因子等，目前已有许多研究证实与肠道菌失调有关；例如普雷沃氏菌的增加、附拟杆菌属（parabacteroide）的菌群增加，而临床患者或者模式动物经过药物的治疗后，这两种菌群会恢复正常水平。国际文献研究干酪菌种的益生菌（例如ATCC 334菌株）具有抑制细胞发炎因子的表现能力、亦具有调整肠道菌群与抗氧化的能力因此开展了利用益生菌来作为缓解类风湿性关节炎的辅疗方式，相关研究也持续的增加。
研究新发现
这篇研究证实，使用干酪乳杆菌Lactobacillus casei CCFM1074，对于诱发关节炎模型的大鼠具有明显的症状改善作用，同时观察多项免疫指标，可已发现在造症组别与喂食CCFM1074的组别之间，发现有肠道菌群以及短链脂肪酸的变化、血液中发炎因子与游离脂肪酸的改变、肠道中免疫T细胞比例的变化，可以得知CCFM1074对于模式动物的生理代谢、免疫平衡起到很好的调节作用，也透过这些研究数据结果，对于自体免疫关节炎疾病的机理提出更深入的探讨与推论，期望提供类风湿性关节炎有更好更多元的临床照护效果。
研究临床应用
动物实验中证实CCFM1074能够改善大鼠自体免疫关节炎的症状，未来可规化评估进入人体临床试验证实其有效性，强化既有的治疗方式。
实验设计
实验内容
实验模式
动物试验分为5组，每组含有8只大鼠。
a.第1组-正常控制组（Normal control，NC）：不以二型胶原蛋白诱发关节炎的控制组
b.第2组– 造症（CIA，collagen-induced arthritis）控制组：以-二型胶原蛋白以及敏感性的大鼠诱发关节炎，但不未服用任何治疗药物或益生菌，仅管喂生理实验水。
c.第3组–MTX（Methotrexate）治疗组：诱发关节炎之大鼠，服用类风湿性关节炎治疗药物Methotrexate
d.第4组- CCFM1074治疗组：诱发关节炎之大鼠，服用益生菌CCFM1074（8.5 * 10^9 CFU/day）
e.第5组- CCFM1075治疗组：诱发关节炎之大鼠，服用益生菌CCFM1075（8.5 * 10^9 CFU/day）
实验流程
实验为期8周，第1天与第7天分别由尾部注射二型胶原蛋白诱发免疫反应，之后同步喂食药物MTX、益生菌CCFM1074、益生菌CCFM1075，持续观测大鼠各项生理数值、图像数据，探讨益生菌对于类风湿性关节炎的改善效果以及作用机理。
检测方法
a.各组体重变化、鼠爪的厚度、关节炎评估分数
b.各组外观照片、CT照片、组织切片照片
c.各组血清中发炎指标变化
d.各组肠淋巴节免疫细胞种类比例
e.各组肠道菌群的组成比例差异
f.各组肠道代谢路径的差异预测
g.各组肠道内短链脂肪酸的变化
实验结果
体重变化（fig A）、脚踝厚度（fig B）、关节炎评量表（fig C）
关节炎老鼠体重会减轻，发生于鼠爪明显发生肿胀之前，药物组与CCFM1074相较于造症组（CIA）都有明显改善的情况，但是CCFM1075相较于造症组（CIA）则无明显差别，显示对于改善关节炎症状没有帮助。
影像数据1-后肢肿胀发炎
可观察到造症组别鼠爪肿胀情况最为严重，同时皮肤红肿变色也最为明显，经过药物MTX治疗后鼠爪肿胀最轻微，但皮肤颜色仍偏红紫色，而CCFM1074益生菌组别肿胀改善程度略低于药物MTX，但是四肢的皮肤红肿颜色的改善却较药物组MTX来的略好一些。
图像数据2-计算机断层摄影
相比造症（CIA）组别，MicroCT图像中可观察到CCFM1074益生菌组与药物组（MTX）的脚踝关节厚度较小且关节较完整。
关节组织切片图
不同组别间关节的组织切片照片，对照组左右两侧骨质、滑膜软骨组织完整，也无发炎细胞渗入。益生菌组别相较于造症组（CIA）别在组织切片图中显示出改善差异。
肠道淋巴细胞的发炎指标激素表现
促发炎细胞激素的检测中可看到在图A中，益生菌组别与药物组都明显降低发炎因子IL-1β的表现到接近正常组别的水平，具有抑制发炎的效果。
血液中免疫细胞的比例变化
与造症组相比较，益生菌组鼠体内的Th17细胞（发炎细胞/路径）数量明显被下调至与正常鼠相同（Fig F），此外相比造症组别CCFM1074增加了Treg的细胞数目（Fig E），强化了体内免疫系统的调整能力、驱动免疫平衡显示出调节免疫力的功能。
各组别大鼠肠道菌群的组成差异
透过软件分析不同组间菌群的分布差异（上图B，beta diversity），可以看到药物组别的菌群分布与CCFM1074较为相近（重叠面积较大），造症组与其他组别有更明显的差异（更少的重叠面积）；以菌门分类（上图C）来说，在灌食CCFM1074的大鼠肠道中拟杆菌门的数量相对于对照组是有显着的增加，而Alistipes与Parabacteroides两菌属（关节炎关连因子）的相对丰度，在喂食益生菌组别中显着降低，益生菌具有调整肠道菌群数量的能力（调节肠道菌群的功能如上图E）。图D则显示整个肠道菌群中，各组别具有显着差异数量的菌种分布情形，这样的结果或可做为未来关节炎风险的检测指标。
代谢差异的资料库比对与软件预测结果
肠道菌群的基因序列资料经过软件PICRUSt2比对资料库后输出可能参与的代谢预测，正常组别与造症组之间的差异有12个代谢差异、CCFM1074与造症组有24的代谢差异、CCFM1075与造症组则只有4个代谢差异，此结果显示CCFM1074更具有调节免疫与生理代谢的功能。
代谢物质的分析-短链脂肪酸SCFA
许多文献研究已证实关节炎鼠的粪便短链脂肪酸含量会少于正常组，本次实验中除了验证这个结果外，同时也可见到CCFM1074具有调节肠道菌群代谢的能力，食用CCFM1074益生菌组别的老鼠粪便中SCFAs显着增加（上图）。
评估血液中代谢物变化
透过质谱仪分析血液中代谢物的变化，（以PCA与OPLS-DA分数分布图呈现）结果如上图，可清楚看到益生菌具有调节大鼠体内代谢物质的能力，在不同组间的血液检体中会产生明显具有差异性的代谢物质。
代谢物质的差异
血清中有差异的代谢物质于组间两两相比之热点图结果如上，A为造症组与正常对照组差异，B为CCFM1074与造症组的差异，C则为CCFM1075与造症组的差异。其中B图可观察到重要差异代谢物质包含有焦谷氨酸[pyroglutamic acid]，EPA[eicosapentaenoic acid]，胆汁酸盐[glycochenodeoxycholic acid]，如同文献研究所述，关节炎模式鼠血清中的游离脂肪酸会较高，常作为检测目标，此结果可以看出CCFM1074明显调降了检测指标物质，具有良好的代谢调节能力。而CCFM1075与造症组之间的差异代谢物多参与氨基酸（phenylalanine，tyrosine，tryptophan）合成代谢相关，无发现明显与类风湿性关节炎相关的指标变化。
差异的代谢物质所参与的代谢路径
研究指出AR患者血清中不饱和脂肪酸（PUFA）会异常增加，上图A为造症组相比对照组代谢影响能力、图B显示CCFM1074相比对照组的代谢影响能力，可见橘色圆圈在B图中，明显小于A图，再次证明了CCFM1074可以下调宿主血清中不饱和脂肪酸的代谢物含量。
菌株间全基因序列分析结果
差异基因所参与的代谢功能
研究指出ATCC334同样具有减缓关节炎症状的功能，将三株菌的全基因序列做比对，依代谢功能分类显示各菌株的基因差异，可以看到对于关节炎有功能的两株菌ATCC334与CCFM1074的碳水化合物代谢功能基因数相较于不具缓解类风湿关节炎的菌株CCFM1075来的更多。
实验结论
CCFM1074菌株可以抑制大鼠体内促发炎的细胞激素IL-1β，并且平衡因为关节炎造成的Th17不正常的细胞比例，同时调节肠道微生物群、血液中代谢物质（尤其是DPA与EPA）以及粪便中短链脂肪酸的含量。透过两株干酪菌株的抗关节炎试验数据来看，要能够改善大鼠关节炎症状，只是改变肠道菌群以外，肠道淋巴节的Treg与T17细胞、与血液中的代谢物质、短链脂肪酸等对于改善类风湿性关节炎可能更为重要，这些试验结果可做为未来对于治疗RA的重要参考。
文章已发表于：Frontiers in Immunology. 2021-May-17；12. doi: 10.3389/fimmu.2021.680073.