【国科科技港】最新农业生物技术专利：关注玉米叶酸基因、高粱单宁变异、鳞翅目杀虫蛋白

透过专利信息跟踪农业生物技术最新研究成果——2021年第24周篇

作者：莱肯生物

很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。

然而，中国的专利年申请量已接近500万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。

本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。

今天让我们看看2021年第24周都公开了哪些农业生物技术相关的专利。

2021年第24周公开的

部分农业生物技术专利简介

关键词：玉米叶酸基因、高粱单宁变异、鳞翅目杀虫蛋白

1、玉米

中国农业大学申请的专利2021102234066（发明人：蒋才富; 梁晓燕; 王向峰）公开了一种玉米耐受盐胁迫导致的渗透胁迫的基因、分子标记和应用。在此抗盐QTL基因内，鉴定了一个位于其内含子上在抗感材料间存在差异的缺失标记。该标记与玉米抗盐性连锁，可作为玉米抗盐分子标记，本发明提供了检测该抗盐分子标记的引物和方法。

中国科学院遗传与发育生物学研究所申请的专利2019112656885（发明人：谢旗; 魏绍巍; 商晓玲; 夏然）公开了玉米ZmbHLH124蛋白质及其编码基因在调控植物耐旱性中的应用。本发明通过将ZmbHLH124基因分别导入单子叶受体植物玉米、水稻和双子叶受体植物拟南芥中发现，ZmbHLH124基因过表达可以提高植物耐旱性。

四川农业大学申请的专利202110368414X（发明人：于好强; 冯文奇; 刘媛; 付凤玲; 李晚忱; 杨青青）公开了玉米ZmBES1/BZR1‑2基因在提高植物耐旱性中的应用，从玉米幼苗叶片中分离获得ZmBES1/BZR1‑2基因，构建35S‑ZmBES1/BZR1‑2‑eGFP载体，通过农杆菌介导法将前述载体转化入植物，该基因在植物中过表达，转基因后的植物抗旱性提升，证实玉米ZmBES1/BZR1‑2基因在改善植物耐旱性中的作用。

上海市农业科学院申请的专利2021101412916（发明人：宋丽莉; 唐雪明; 施标; 郑洪建; 武国干; 王金斌; 黄艳娜; 吕贝贝; 刘华）涉及ZmGGH基因的应用及调控玉米叶酸含量的材料及方法。本发明提供了ZmGGH基因在调控玉米叶酸含量中的应用，过表达ZmGGH基因玉米叶酸含量下降48.1～70.3%，ZmGGH基因突变将提高叶酸含量。

2、分子标记

河南农业大学申请的专利2021104071504（发明人：陈甲法; 吴建宇; 李欢; 周波）涉及一种用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记及应用。上述的用于检测糯玉米waxy基因的功能性分子标记可用于鉴定糯玉米自交系，采用PCR加电泳的方法来检测差异。本发明开发了一个针对waxy基因的变异位点的功能分子标记，其可以直接检测waxy基因的变异，用于分子育种，从而提高育种中选择的准确性。

华中农业大学申请的专利2021103331190（发明人：何燕红; 韦陆丹; 余晓敏; 王亚琴; 张春玲; 王文静; 包满珠）公开了鉴别万寿菊瓣型的CAPS分子标记、检测引物及检测试剂盒。本发明利用BSR‑seq技术获取与万寿菊瓣型紧密连锁的SNP位点筛选并转化为CAPS标记Marker 67，其在复瓣万寿菊的序列为SEQ IDNO:2所示；应用该分子标记能对万寿菊复瓣与单瓣进行准确区分，在万寿菊单复瓣F2分离群体中检测效率达98.96%，在70份万寿菊商业品种和自交系中检出率达85.71%。本发明还提供了CAPS分子标记Marker 67的检测引物以及鉴定万寿菊瓣型的PCR检测试剂盒。本发明在苗期对万寿菊的实生苗进行分子标记辅助育种，有效提高了育种效率。

南京农业大学申请的专利2021102637616（发明人：娄群峰; 宋蒙飞; 付文苑; 陈劲枫）提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物可快速对黄瓜微型化性状进行鉴定。

四川农业大学申请的专利2021102924269（发明人：祁鹏飞; 王琰; 陈庆; 石晓丽; 郭祯儒; 吴汪; 李庆成; 王际睿; 江千涛; 成国跃; 蒲至恩; 魏育明; 郑有良）公开了一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物及应用。该分子标记能有效的对Q和Qc1SNP变异位点进行基因分型，可以更加高效的在实验室条件下对待测材料进行筛选和鉴定。与Q相比，Qc1可使小麦籽粒蛋白含量提高，面包体积增大。本发明的KASP标记可用于替代或辅助目前实验室使用的PCR扩增、测序鉴定Qc1SNP等位基因的方法，从而提高材料选育的效率，降低实验成本，为小麦加工品质的改良提供分子辅助选择手段。

江苏里下河地区农业科学研究所申请的专利2021104739474（发明人：胡文静; 高德荣; 张勇; 陆成彬; 吴宏亚; 刘健; 张春梅; 李东升）公开了一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用。利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦4号的1个与赤霉病抗性相关的主效QTL位点QFhb‑6B‑YM4，其紧密连锁标记是AX111634185，并据此开发了1个KASP标记引物组，用以对赤霉病抗性高低进行高效筛选。通过本发明的引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦4号的赤霉病抗性高的基因。

山东农业大学申请的专利2021103315554（发明人：武玉叶; 张文彬; 王海莲; 刘树兵）公开了调控高粱籽粒单宁有无基因Tannin1编码区内一个新型的功能性等位变异，特定区域10碱基的缺失（CGACATACGT），命名为tan1‑e变异类型。这种功能性等位变异导致高粱籽粒单宁丧失。

江西省农业科学院作物研究所申请的专利2021103419356（发明人：辛佳佳; 谭河林; 谷德平; 徐亮; 戴兴临; 张洋; 涂玉琴; 涂伟凤; 汤洁; 万鹏）涉及一种检测油菜叶缘深缺刻标记性状的分子标记及其应用。本发明提供引物对，一种PCR试剂，该PCR试剂包括上述的引物对。本发明克服现有技术中无法从分子层面确认油菜的叶缘深缺刻性状的基因是否转育成功的缺陷，从而提供一种检测油菜叶缘深缺刻标记性状的分子标记及其应用，加快油菜品种的选育。

武汉基诺赛克科技有限公司申请的专利2020116102142（发明人：张毅; 王博; 李娟娟; 王娟; 张倩; 柳依）具体涉及水稻1K SNP‑Panel的开发方法与育种应用。所述基因检测技术包含1253个均匀覆盖水稻全基因组的SNP标记，且最高可达到同时进行10000个样品的检测，且针对每一个SNP标记有一对相对应的特殊的引物，所述引物通过多重PCR和高通量测序技术进行高通量检测获得DNA序列数据，并通过自主开发的专门软件“GKPanel”，自动化完成指定的数据分析，给出相应的基因型数据。

3、大豆

中国农业科学院植物保护研究所申请的专利2021104029649（发明人：孔令安; 石雪; 彭德良; 王高峰; 黄文坤; 彭焕）提供一个从大豆孢囊线虫克隆的几丁质合成酶基因SCN‑CHS。选用大豆孢囊线虫几丁质合成酶基因（SCN‑CHS）的几丁质合成核心结构域，以此结构域为靶点构建寄主植物介导的基因沉默（HIGS）转基因植株，表明HIGS植株对SCN的影响不依赖于生理小种，且对SCN的影响可稳定遗传。本发明将有助于解析几丁质合成酶基因SCN‑CHS在大豆孢囊线虫中的生物学功能，明确基于RNAi开发的HIGS植株在防控大豆孢囊线虫病害的应用潜力。

华南农业大学申请的专利2021102797367（发明人：马启彬; 李璐; 年海; 程艳波; 蔡占东; 李新岗）公开了一种耐铝相关基因GsERF1及其编码蛋白与应用。本发明的基因GsERF1对大豆抵抗铝胁迫具有积极作用。经过实验证明，将该基因超表于拟南芥中，可提高转基因拟南芥的主根相对伸长率，同时增加脯氨酸含量，说明该蛋白可以为培育具有较强耐铝能力的转基因植物的研究奠定基础。

4、基因编辑

西北农林科技大学申请的专利2021101955880（发明人：魏春华; 张显; 张锐敏; 李佳悦; 李好; 张勇; 马建祥; 杨建强; 岳贞）公开了一种通过基因编辑技术创制西瓜雄性不育新种质的方法。本发明首次利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对基因ClATM1或其保守结构域进行基因编辑敲除，使得该基因功能缺失或者出现突变，从而形成隐性细胞核雄性不育表型。通过本发明方法创制的雄性不育系与正常的材料相比，除了雄花的育性发生改变外，其他组织如雌花、叶、卷须、茎、根、生长势等都无可见表型变化；如果将创制的雄性不育新种质用于杂交种生产或群体改良，将大幅度降低人工成本，同时提高育种制种效率。

山东大学申请的专利2021103206684（发明人：黄启来; 刘晓丹; 杜平; 李博; 杨乐乐; 任乃霞; 李莹莹）提供高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和基因突变检测中的应用。本发明通过对野生型全长Taq DNA聚合酶进行了半理性的定向分子进化来提高其特异性。选取Taq酶上与引物/模板复合物有直接相互作用的全部极性氨基酸进行逐个突变，获得40个Taq变体，然后在这些变体及野生型序列的基础上进行广泛的随机诱变，生成Taq突变体文库。在qPCR筛选系统上，以基因组编辑indels质粒为模板，筛选出一系列具有高特异性的Taq突变体，在CRISPR/Cas9编辑效率评估和单细胞克隆基因分型中展现出了极大的优势。

耶鲁大学申请的专利2019800709803（发明人：E·基哈诺; A·图奇克; P·格莱泽）涉及用于增强基因编辑的组合物和其使用方法。该组合物含有细胞穿透抗体和供体寡核苷酸，该供体寡核苷酸含有可以校正细胞的基因组中的突变的序列。优选地，该组合物不含核酸酶、PNA或纳米颗粒。这些组合物用于通过使细胞与有效量的该组合物接触来修饰该细胞的基因组。与不存在该细胞穿透抗体相比，当细胞与该细胞穿透抗体和该供体寡核苷酸接触时，基因组修饰在离体和体内均以较高频率发生。

安徽农业大学和浙江农林大学申请的专利202110325672X（发明人：许永汉; 林新春; 马传喜; 李金才; 胡晓渝; 王晓波; 武德传; 齐泽宇; 吕蔺; 蒋欣瑜; 桂昊）公开了同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及元件结构，所述方法包括：(1)以靶区段300‑400bp DNA序列为基础，其中插入或缺失多个DNA片断形成MsDFID序列，同时作为向导RNA和供体模板，也被称为MsDFID向导和供体RNA；(2)在所述MsDFID供体模板3’端连接成簇且规律间隔短重复DNA回文结构，即PCRISR，或Cas9向导RNA骨架，或大肠杆菌CRISPR‑Cas3回文重复序列。后面这三种序列均作为向导RNA骨架；(3)用上述融合序列构建供体载体，转化大肠杆菌，MsDFID供体模板内供体位点所含DNA片断插入或缺失被替换到靶区段对应位点。本发明成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑，解决当前基因编辑系统面临的几个主要问题：对PAM序列依赖、较高脱靶风险和难以实现精准序列替换。

江西农业大学申请的专利2021101802550（发明人：唐玉新; 宋德平; 张帆帆; 叶昱; 黄冬艳）提供一种m6A“阅读器”YTHDF2基因改造方法及其应用。本发明的基因改造方法利用基因编辑技术对YTHDF2基因进行改造，获得敲除YTHDF2基因的细胞系，包括：sgRNA序列的设计，YTHDF2基因敲除，质粒构建和改造基因重组细胞系筛选。本发明对具有特异性基因的细胞进行基因改造，并首次提出在Vero81细胞中使用CRISPR/Cas9技术对YTHDF2基因进行敲除、插入、碱基突变，为细胞学或基因学研究提供了全新的概念，具有十分广泛的应用前景；本发明提供的Vero细胞系YTHDF2基因改造方法能够改变宿主细胞中mRNA甲基化水平，从而改变病毒增殖能力，为研究病毒与宿主甲基化的关系提供可能。

西北农林科技大学申请的专利2021103650853（发明人：张智英; 邢佳妮; 麻丽霞; 闫强; 李鹏程; 徐坤; 程心珍; 闫娜娜; 孙永森; 李倩）公开了一种原核Argonaute蛋白的基因编辑应用，通过构建源于细菌的Argonaute蛋白的原核表达载体，以及在转化宿主细胞后对该Argonaute蛋白的表达载体和共转化载体的降解的检测以及基因组位点的检测，发现了其具有被特异性转录本激活并靶向特定DNA靶序列的能力，并且在真核细胞中转录的导向RNA的参与下，实现了对基因组靶序列进行inDel频率为3%的基因编辑。实验结果表明原核Argonaute蛋白可以用于细胞内基因编辑工具的开发。

东北林业大学申请的专利202110202177X（发明人：刘桂丰; 王伟; 邱志楠; 李爽; 姜静; 陈肃）本发明公开了一种靶向敲除GLK基因的CRISPR/Cas9系统及其应用。本发明通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同时能靶向白桦GLK基因的高效gRNA及靶位点序列，具体以白桦GLK基因为编辑靶基因，将体外纯化的Cas9蛋白与GLK‑gRNA混合后的核糖核蛋白复合体RNP，通过微粒轰击白桦愈伤组织，初步建立无T‑DNA插入基因编辑技术，利用该基因编辑技术获取了白桦黄叶植株。

香港大学申请的专利2019800617939（发明人：黄兆麟; 蔡正姿）提供一种用于通过组合修饰产生和筛选基因变体的改进的高通量系统和方法。还提供由该系统产生的优化的SpCas9酶变体。

5、其他

孟山都技术公司申请的专利202080005803X（发明人：D·J·伯温; C·A·蔡; 陈丹琦; T·A·奇彻; A·R·豪; J·L·卢特凯; B·E·威金斯; 张远记）公开了表现出针对鳞翅目害虫物种的毒性活性的杀虫蛋白，并且所述杀虫蛋白包括但不限于TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3。

本发明还公开了用于提高杀虫蛋白针对昆虫害虫物种的杀虫活性的方法和组合物。进一步公开了用于减少转基因植物的生殖组织中杀虫蛋白的表达的方法和组合物。

贝林格尔·英格海姆RCV两合公司、瓦利多根股份有限公司和隆萨有限公司申请的专利2019800564490（发明人：R·察尔; J·博加德; K·鲍曼; D·玛塔诺维克; B·加塞尔）通过使用转录因子来增加蛋白质表达的手段和方法。本发明一般涉及一种通过过表达编码本发明的至少一种转录因子（优选Msn4/2）的至少一种多核苷酸来增加真核宿主细胞（优先酵母菌）中目标蛋白（POI）的产量的方法。本发明进一步涉及一种用于制备POI的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达编码至少一种转录因子的至少一种多核苷酸，以及所述宿主细胞用于制备POI的用途。

浙江省农业科学院申请的专利2021101500758（发明人：何艳军; 范敏; 张慧青; 李玉林; 姚依秀）涉及一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法。本发明的蛋白ClALKBH2B是一个质膜定位的蛋白，ClALKBH2B过表达后第3天，能明显抑制CGMMV病毒的积累水平。

湖南农业大学申请的专利2021101354018（发明人：黄勇; 潘娇; 张蕾; 陈敏; 阮雨萱; 刘博宇; 阮颖; 皮博艺; 何小力）涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法。本发明以甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的DNA片段设计引物对BnTZF1A‑RRF和BnTZF1A‑TZFR，构建重组原核表达载体，转化表达细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物纯化后得到的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体。制备得到的甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体特异性好。

四川农业大学申请的专利2021101268417（发明人：符书兰; 唐宗祥; 罗杰; 邹杨）涉及一种提高小麦染色体重组频率的方法。使用本发明所提供的方法通过减数分裂过程中的染色体重组，可以实现两亲本之间的基因重排，从而获得新型的、有利的基因组合方式，为选育小麦新品种奠定遗传基础。在本发明所提供的方法中，以染色体臂间结构差异大，亚端部结构相似或染色体臂间结构相似，亚端部结构差异大的亲本进行杂交。采用本发明所提供的方法获得的杂交后代可用于辅助育种中，有利于快速准确地获取小麦杂交新品种。

结案专利详察

深圳华大基因科技有限公司（后变更为深圳华大智造科技有限公司）申请的专利《一种基因文库的筛选方法2014105052784》（发明人：刘远红; 毛丹青; 谢洪涛; 原辉）经过实质审查后于2018年3月22日被驳回。申请人于2018年6月15日请求复审，合议组经过审查，认为权利要求请求保护的技术方案不具备创造性，因此最终于2020年7月28日做出了维持原驳回决定的审查决定。今天，就让我们详细看看这个专利。

1、发明内容

本发明公开了一种基因文库的筛选方法，包括如下步骤：提取基因文库的多个文库池或文库单克隆的质粒；打断所述质粒，构建测序用的片段文库；对所述片段文库进行测序，得到测序读段序列；和将已知目的序列与所述测序读段序列比对，得到比对上的读段序列对应的阳性文库池或文库单克隆。

本发明通过测序和比对的方式实现基因文库的筛选，相比传统方法，无需大量引物和探针；避免了由于实验试剂或人员操作等造成的假阳性或假阴性，准确度极高，并且操作时间大大缩短；只需较低的测序深度（2×左右）即可满足实验要求，且测序读段序列无需组装；并且针对需要调取的文库池或文库单克隆，无需重新实验，只需重新进行数据比对，因此该方法简单有效。

2、驳回决定

国家知识产权局原审查部门经实质审查于2018年3月22日以权利要求1-15不具备创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所针对的权利要求书如下：

“1. 一种基因文库的筛选方法，包括如下步骤：

提取基因文库的多个文库池或文库单克隆的质粒；

打断所述质粒，构建测序用的片段文库；

对所述片段文库进行测序，得到测序读段序列；和

将已知目的序列与所述测序读段序列比对，得到比对上的读段序列对应的阳性文库池或文库单克隆。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述打断所述质粒，构建测序用的片段文库的步骤具体包括：用打断仪打断所述质粒；对打断的片段进行末端修复；和连接接头并进行缺口平移反应。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缺口平移反应后，选择预定长度的片段用于测序。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预定长度为100~5000bp。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预定长度为100~2000bp。

6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预定长度为100~500bp。

7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预定长度为200~250bp。

8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述选择预定长度的片段通过琼脂糖凝胶电泳和切胶回收进行。

9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序的测序深度为1.5以上。

10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序的测序深度为2.0以上。

11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序的测序深度为2.0。

12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因文库为Fosmid文库、Cosmid文库、BAC文库或YAC文库。

13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基因文库为Fosmid文库，所述Fosmid文库的库容为基因组DNA的10倍。

14. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因文库以文库池或文库单克隆的形式保存于微孔板中。

15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述微孔板为96微孔板。”

驳回决定认为：（1）权利要求1要求保护一种基因文库的筛选方法，对比文件1（生物制药工艺技术，陶杰等，中国医药科技出版社，2013年02月28日）公开了从基因文库中获取目的基因的方法（参见“从基因文库中直接获取目的基因”，第247-249页），包括将生物细胞DNA切割后与载体连接形成质粒后进入细胞形成克隆，之后通过特异性引物PCR扩增获取目的基因。权利要求1和对比文件1相比，区别技术特征在于，提取质粒后采用测序比对序列的方法获得目的克隆。然而，对于文库构建后，也可采用全基因组测序方式获得每个克隆的序列，如对比文件3（“水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani AG1IA Fosmid基因组文库的构建及线粒体全基因组组装分析”，秦培钢，中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑2012年第5期D046-39）公开了一种水稻纹枯病菌的基因组提取以及基因组文库的构建方法，并在进行全基因组测序时测出线粒体序列，在NT database数据库对已测数据BLAST比对鉴定线粒体基因（即目的序列与测序序列进行比对）。而且从理论上来说，如果将每个克隆都进行测序，并和目的基因进行比对，必然可以通过大量劳动获得目的克隆，这属于本领域技术人员根据现有技术可以合理推断而获得的结果。因此，权利要求1相对于对比文件1和对比文件3不具备创造性，其从属权利要求9-15同样不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。（2）从属权利要求2进一步限定了构建测序片段文库的步骤，对比文件2（CN102560688 A）公开了在构建基因组文库时，先进行DNA提取，回收一定38-48KB的片段，进行末端平滑化和磷酸化处理，并与pCCGO载体连接，本领域技术人员可以根据需要具体选择使用的打断方法和缺口平移方法，因此权利要求2也不具有创造性，其从属权利要求3-8同样不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。

3、复审请求

申请人深圳华大智造科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年6月15日向国家知识产权局提出复审请求。同时修改了权利要求书在原权利要求1中增加了“所述测序的测序深度为2×，所述测序读段序列无需组装直接用于比对”的特征。请求人认为：

（1）文库构建后克隆量巨大，每个克隆都进行测序并不现实，因此，不会有人想到可以采用测序比对序列的方法筛选目的基因，本申请正是克服了这样一个公知的技术偏见，创造性地采用测序比对的方法进行基因文库筛选。（2）对于全基因组而言，为了保障全基因覆盖率和测序的准确性，通常要求测序深度在50-100×以上，一般的基因组测序也要求测序深度在10-15×以上，而本申请的基因文库筛选方法不同于一般的基因测序，只要求较低的测序深度（2×左右）即可，并且，对于测序读段序列也不需要组装，直接用于比对，大大减少了测序工作量。因此，本申请权利要求1-15具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。

4、前置审查

原审查部门在前置审查意见书中认为：采用测序方法筛选阳性克隆，虽然现有技术中不常使用，但并不代表现有技术中存在该方法无法获得结果的技术偏见，只是工作量大、效率较低而已；对于测序深度，本申请采用较低测序深度，但并不能取得同时提高准确率的技术效果，因而坚持原驳回决定。

随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。

5、合议组审理

合议组认为：

（1）权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1相比，主要区别在于：权利要求1采用核苷酸测序方法获得文库质粒中基因的核苷酸序列信息，并与目的基因序列进行比对，从而筛选到包含目的基因序列的阳性克隆，同时限定了测序深度为2×，且核苷酸序列无需组装直接用于比对。然而，对比文件1给出了依据基因核苷酸序列信息来获取目的基因的技术启示，同时本领域技术人员也知晓特异性引物进行PCR扩增和核苷酸测序均是获取基因核苷酸序列信息的常规方式的情况下，本领域技术人员能够根据本领域中核苷酸测序工作的日益广泛普及，通过合乎逻辑的分析即可以想到采用核苷酸测序的方法来筛选目的基因并通过序列比对获得阳性文库。至于测序深度，则是本领域技术人员根据测序片段和目的基因序列的大小，以及所允许的测序错误率或假阳性结构等测序需求而常规选择的；在不进行组装的情况下，直接将测得的核苷酸片段序列与目的基因序列进行比对也是本领域技术人员的常规选择。因此，权利要求1的技术方案相对于对比文件1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）权利要求2-8的特征被对比文件2公开，权利要求12-13的特征被对比文件1公开，同时也是本领域技术人员的常规选择，上述权利要求同样不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。权利要求9-11所限定的测序深度、以及权利要求14-15所限定的基因文库的保存方式均是本领域技术人员可以依据常识和需求进行适当选择的，同样不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。

复审请求人认为：（1）虽然目前基因测序技术已经取得了突飞猛进的发展，但是在本申请的申请日2014年，基因测序并没有如今这般便捷，即便本领域技术人员知道直接测序可以获得准确完整的核苷酸序列信息，且庞大的工作量不足以导致本领域技术人员产生技术偏见，但工作量庞大足以让本领域技术人员望而却步。（2）为了保障全基因覆盖率和测序的质量，通常要求测序深度在50-100×以上，一般的基因组测序也要求测序深度在10-15×以上，而本申请的基因文库筛选方法不同于一般的基因测序，可以牺牲测序深度，只要求较低的测序深度（2×左右）即可，并非常规选择，并且，对于测序读段序列也不需要组装，直接用于比对，大大减少了测序工作量。因此，本申请权利要求1-15具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。

6、复审决定

专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。

根据该款规定，如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的，也就不具备突出的实质性特点。

权利要求1要求保护一种基因文库的筛选方法，对比文件1公开了基因文库的构建（参见“从基因文库中直接获取目的基因”，第247-249页），包括将基因组DNA切割成大小合适的片段，并与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存即得基因组文库。同时公开了从已构建的基因文库中获取目的基因的方法，其中获取目的基因依据的有关信息包括：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物蛋白质等特征，由此可以采用以下策略来筛选目的基因，包括用特异探针进行分子杂交，用免疫和生化方法来检测基因产物，或用特异性引物进行PCR扩增获取目的基因。由此可见，对比文件1公开了依据基因的核苷酸序列信息来筛选获取目的基因，给出了用特异性引物进行PCR扩增的明确信息。权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1相比，主要区别在于：权利要求1采用核苷酸测序方法获得文库质粒中基因的核苷酸序列信息，并与目的基因序列进行比对，从而筛选到包含目的基因序列的阳性克隆，同时限定了测序深度为2×，且核苷酸序列无需组装直接用于比对。然而，在对比文件1给出了依据基因核苷酸序列信息来获取目的基因的技术启示，以及本领域技术人员也知晓特异性引物进行PCR扩增和核苷酸测序均是获取基因核苷酸序列信息的常规方式的情况下，本领域技术人员能够根据本领域中核苷酸测序工作的日益广泛普及，通过合乎逻辑的分析即可以想到采用核苷酸测序的方法来筛选目的基因并通过序列比对获得阳性文库。因此，权利要求1中采用核苷酸测序方法获得阳性文库的特征不能为所要求保护的技术方案带来突出的实质性特点。至于测序深度，则是本领域技术人员根据测序片段和目的基因序列的大小，以及所允许的测序错误率或假阳性结构等测序需求而常规选择的；在不进行组装的情况下，直接将测得的核苷酸片段序列与目的基因序列进行比对也是本领域技术人员的常规选择，上述特征同样不能为所要求保护的技术方案带来突出的实质性特点。综上，权利要求1的技术方案相对于对比文件1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。

权利要求2引用权利要求1，进一步限定了构建测序片段文库的步骤，对比文件2公开了在构建基因组文库时，对测序片段进行末端修复和连接接头（参见其第0016段-0024段），本领域技术人员还可以根据需要具体选择使用的打断质粒的方法和缺口平移方法，因此权利要求2也不具有创造性。其他从属权利也不具有创造性。

对于复审请求人的意见，合议组认为：（1）对比文件1给出了依据基因核苷酸序列信息来获取目的基因的技术启示，本领域技术人员根据本领域中核苷酸测序工作的日益广泛普及，通过合乎逻辑的分析即可以想到采用核苷酸测序的方法来筛选目的基因并通过序列比对获得阳性文库。另外，采用测序方法获取核苷酸序列信息的方式在申请日前的现有技术中也通常被采用，例如公开于2012年的对比文件3在鉴定水稻纹枯病菌是否含有目标基因序列时，不仅采用了特异性引物扩增的方式，还同时采用了测序的方式，即将其余样品送华大基因公司进行测序，并将所测得的序列在NCBI网站上与已经公布的标准菌株的序列进行比对，根据比对结果确认菌株属于AG1 IA。此外，虽然将每个文库克隆都进行测序，并和目的基因进行比对，会导致因文库量巨大而使得测序工作繁重，但是，工作繁重并不足以导致本领域技术人员形成不采用此种测序方式的技术偏见，所述方式并未在技术本身取得进步，在测序手段更为普及或廉价时容易被本领域技术人员所考虑。（2）至于测序深度和无需组装的特征，如前所述，测序深度是测序过程中保证基因组覆盖率和控制测序错误率的常规指标，是本领域技术人员根据测序片段和目的基因序列的大小，以及具体的测序目的所允许的测序错误率或假阳性结构等测序需求而进行的常规选择，本申请采用较低测序深度，其也仅仅是满足其测序目的而已，并没有证据表明其能取得与较高测序深度同样的准确率，能够取得预料不到的技术效果；另外，直接将测得的核苷酸片段序列与目的基因序列进行比对，而不进行组装，也是本领域技术人员的常规选择，本申请并没有实验数据能够表明上述不进行组装的选择会为所要求保护的技术方案带来何种预料不到的技术效果。综上，复审请求人的意见不具备说服力。

因此合议组维持了国家知识产权局于2018年03月22日对本申请作出的驳回决定。

7、总结

本案中，申请人认为2×左右测序深度以及测序读段序列直接用于比对是本技术方案体现创造性的两个关键特征。然而，合议组认为：测序深度和序列直接比对是本领域技术人员根据实际情况做出的常规选择。本发明并没有证据表明其能取得与较高测序深度同样的准确率，能够取得预料不到的技术效果；也没有实验数据能够表明不进行组装的选择会为所要求保护的技术方案带来何种预料不到的技术效果。缺少展示关键技术特征技术效果的实验数据，是本申请最终被驳回的主要原因。