文章解读 | 染色体不稳定性驱动癌细胞转移

研究人员通过原发肿瘤-转移肿瘤的基因组分析等一系列方法，确定了癌细胞转移的遗传机制，即由染色体不稳定性驱动，为未来癌症治疗提供新的思路。

文章题目：Chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic DNA response

研究人员：来自康奈尔医学中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心等多个研究机构

发表时间：2018. 01.17

期刊名称：Nature

影响因子：40.137

研究背景

染色体不稳定性（CIN）与肿瘤转移相关，但其在肿瘤转移过程中扮演的角色尚不明确。染色体不稳定的细胞在细胞分裂后期会发生染色体错误分离，这为靶向探究CIN在癌症转移中的作用中带来了困难。非运动微管解聚驱动蛋白家族KIF2B或KIF2C（也称作MCAK）过度表达所造成的附着在染色体上的微管的不稳定性，能够直接抑制染色体不稳定细胞中的CIN。过度表达KIF2B或MCAK的细胞可以继续以非整倍体进行分裂。非整倍体是染色体异常中的一种，因此，可通过这种方法可以直接检测CIN。

研究方法

样本选择：

从基因型和表型（dbGAP）的数据库中下载具有匹配的原发性肿瘤和正常组织的79个脑转移瘤的全外显子DNA序列数据；

研究手段：

  • 原发肿瘤-转移肿瘤的基因组分析

  • 头颈部鳞状细胞癌染色体分离分析

  • 单细胞核型分析

  • FISH分析

  • RHOA和RAC1下拉实验

  • 免疫荧光显微实验

  • Y染色体错误分离和FISH实验

  • 在微流体装置中进行细胞迁移

  • 动物实验

  • 患者来源的异种移植实验

  • RNA测序和分析

  • 逆转录酶定量聚合酶链反应

  • 单细胞RNA测序

  • 病人生存分析

  • 体外侵袭和迁移测定

  • 细胞质DNA定量分析

研究成果

人转移瘤中CIN增多

图1  人转移瘤中CIN增多

首先，为了确定CIN是否与肿瘤转移相关，研究人员用加权的基因组完整性指数（wGII）作为衡量CIN的指标，研究人员对一个已发表的79对原发癌和转移癌进行了分析。分析发现转移瘤中wGII指数更高（图1a）。

随后，对原发乳腺癌和转移癌的核型分析发现原发癌中均为二倍体，而转移癌中存在大量的三倍体，并且染色体畸变数量是原发性肿瘤的两倍。核型在二倍体~四倍体之间的样本染色体畸变是最高的（图1b,c）。

最后，对局部晚期头颈部鳞状细胞癌患者的原发肿瘤组织学分析揭示，细胞分裂后期染色体错误分离与淋巴结转移发生率之前存在显著的相关性（图1d）。

CIN是癌细胞转移的驱动者

图2  CIN是癌细胞转移的驱动者

为了确定CIN与癌细胞转移是不是因果关系，研究人员用了人(MDA-MB-231)或小鼠(4T1)乳腺癌转移性肿瘤模型和人肺腺癌(H2030)，均发现了染色体错误分离的证据。

过表达的KIF2B或MCAK抑制了染色体错误分离，而过表达的显性抑制MCAK突变体（dnMCAK）促进了染色体错误分离。KIF2B或MCAK的过表达不会影响细胞增殖和每个细胞中心体的数量（图2a,b）。作为对照，研究人员过表达了KIF2A（驱动蛋白家族成员，缺少着丝粒定位结构域），发现其影响微管解聚，但对CIN影响不明显（图2b）。研究人员将表达MCAK或KIF2B定义为CIN-low,将表达KIF2A或dnMCAK定义为CIN-high。

转移癌的核型分析显示了广泛的非整倍性（≈3n）染色体和核型异质性。抑制CIN同时减少了单细胞来源克隆的异质性核型数目和异质性核型结构。而CIN-low细胞中一些出现了非克隆性结构异常的染色体染色体数目异质性减少。值得注意的是，CIN-low的细胞仍然维持较高程度的非整倍体核型，但可以稳定繁殖。这样，通过比较染色体上稳定的非整倍体细胞与染色体不稳定非整倍体细胞，研究人员可以通过实验研究CIN在转移中的角色。

研究人员通过给无胸腺小鼠注射MDA-MB-231细胞，使用生物荧光标记追踪细胞的扩散情况。在转移上染色体错误分离的比率显著不同：注射CIN-high细胞的小鼠迅速死于转移性疾病（生存期中位数70天）；而注射CIN-low细胞的小鼠转移负担比较低。生存期中位数207天。CIN-low的转移会逐渐衰退，有的会自愈；而CIN-high的细胞会转移多个器官，进展迅速，导致死亡。人肺腺癌细胞中有类似结果（图2c-e）。MCAK表达细胞中MAD2过表达减少了部分染色体错误分离，并相应的增强转移（图2c）。研究人员还实验发现，CIN抑制对原发癌的着床效率无影响。但显著减少了自发转移并延长生存期。

图3  CIN在原发肿瘤和转移灶中的作用相反

然后研究人员评估了注射细胞、原发癌细胞、转移癌细胞中的染色体错误分离情况（图3a）。主要使用MDA-MB-231细胞、ER 和TNBC病人的细胞。注射细胞中，无论CIN状态如何，转移细胞中染色体错误分离比例更高些，然原发瘤中CIN水平明显偏低（图3b-d）。

间充质细胞富含CIN

Bulk RNA-seq分析在CIN-low细胞和CIN-high细胞中共鉴定了1584个显著差异表达的基因。主成分分析和聚类分析均根据CIN状态分离了样本。转移相关和上皮间质转化（EMT）相关基因在CIN-high细胞中显著富集。CIN-high细胞中最显著差异表达的基因在功能上与无远处转移生存（DMFS）有关。数据库来源的乳腺癌数据中的验证实验也是类似。

原发瘤和转移瘤RNA-seq分析显示了转移和CIN-high细胞之间的通路。但是转移瘤中包含了大量上调EMT和炎症相关基因不成比例的聚集在1号染色体。核型分析显示在注射的细胞和转移的细胞中，1号染色体均是3份拷贝，而原发癌中仅是2倍体。这样在这个模型中，1号染色体丢失是原发癌生长的一个高频事件。

图4  间充质细胞富含CIN

然后研究人员分别在3株MDA-MB-231细胞系（2个CIN-low和1个CIN-high），共6,821个细胞，进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析。EMT相关基因聚类分析，根据CIN状态，成功的将大多数细胞分类（图4a）。所有表达基因的聚类分析确定了12个亚型。一个亚群被定义为EMT和转移相关的高表达，并且伴随着丰富的CIN特征基因。与6%的CIN-low细胞相比，这个亚群45%的是dnMCAK细胞（图4b）。

CIN产生胞浆DNA

图5  CIN产生胞浆DNA

为了确认CIN应答途径，研究人员用scRNA-seq的数据，计算基因间的Pearson相关性系数，确认了2大基因模块：模块1与细胞增殖和代谢有关；模块2与EMT（上皮间质转化）和炎症相关（图5a）。而且scRNA-seq和bulk RNA-seq数据皆证实了炎症相关基因、CIN特征、EMT基因间强烈的正相关关系（图4b，图5b）。

CIN应答途径与炎症反应相关，这个结果出乎意料，并且让人联想到病毒感染。因此研究人员研究了CIN是否将染色体DNA释放到细胞质中，从而引起了抗病毒免疫的炎症反应。染色体DNA暴露到细胞质可能是由细胞核或者微核包膜破裂。研究人员采用NLS–GFP进行活细胞成像，发现在没有限制的条件下，CIN和染色体DNA暴露到细胞质是没有相关性的。在CIN-high细胞中甚至有细胞核修复的趋势。CIN-high仅在限制迁移的时候核破裂更加频繁，这可能是与它们在转移过程中模仿受限迁移的能力增强有关。

相反地，CIN-high细胞和转移来源细胞的微核数目要分别比CIN-low或者原发瘤细胞多（图5c-e）。为了验证微核易破裂是否和细胞质DNA增多有关，研究人员选择了质膜选择性透过的两种不同的anti-dsDNA抗体进行细胞染色，在CIN-high细胞中发现增多的细胞质dsDNA和ssDNA。在双链特异核酸酶处理以及DNASE2过表达后dsDNA信号消失（图5f）。亚细胞分离之后，与CIN-high细胞相比，CIN-low的细胞质DNA减少为四分之一（图5g）。

为了验证染色体错误分离是否提供了细胞质DNA，研究人员使用了在染色体稳定的大肠癌肿瘤细胞DLD-1中建立的可诱导Y染色体错误分离系统。发现在多西环素和生长素（Dox/IAA）处理2-3天后，Y染色体进入到微核中（图5h）。从而证实了细胞质DNA来源于高发生率的染色体错误分析。

抑制微核包膜破裂减少了细胞质中的双链DNA，不影响染色体分离的错误率。实际上，MDA-MB-231细胞心内或尾静脉注释后，这种过表达减少了转移（图5i）。

转移原于细胞质DNA的反应

图6  转移原于细胞质DNA的反应

在染色体稳定的细胞中，细胞质dsDNA是非常少的，且可被cGAS–STING通路感知，导致I型干扰素刺激基因（ISGs）的诱导。事实上，在DLD-1中，诱导Y染色体分析导致了OAS2、ISG基因的上调和β干扰素的增加。目前不确认染色体不稳定的细胞如何应对持续的细胞质DNA。抑制微核破裂明显的减少了cGAS 的相对分数（图6a，b）。此外，与通路激活一致，CIN-high细胞展示了增高的水平和SITNG核定位（图6c）。

细胞质DNA能够激活NF-κ B通路。研究人员发现了CIN-high中非经典NF-κ B通路被激活、NF-κ B通路抑制剂TRAF2减少的证据。STING的消耗减少了RELB的核定位，导致了EMT和炎症通路的下调；而在MCAK表达细胞中cGAMP增加或MAD2过表达增加了细胞核中的RELB基因（图6d）。

Bulk RNA-seq鉴定了一些非经典NF-κ B通路的靶基因（在CIN中上调）。STING、CIN应答的NC-NF-κ B基因具有很强的相关性。相比之下CIN和I型干扰素靶基因间的相关性较弱（图5b）。类似地，TCGA数据库中原发乳腺癌RNA-seq数据显示了在CIN特征明显的肿瘤中CIN应答NC-NF-κB基因表达量增加（图6e），并且NF-κ B通路调节因子表达量升高，它的CIN应答靶基因与乳腺癌和肺癌生存时间延长有关。相反地，正常型核的NF-κ B或I型干扰素调控因子表达量增加与预后改善有关。

cGAS被肿瘤细胞通过肿瘤细胞非自主机制在脑转移中激活。研究人员发现STING和下游非经典NF-κB通路以肿瘤细胞自主的方式介导转移，减少转移，延长生存时间。相反地，cGAMP增加促进了细胞的侵袭和迁移（图6f，g）。这些发现与EMT中非经典NF-κB通路、细胞侵袭转移的作用相一致。

讨论

这篇文章揭示了CIN、细胞质DNA感应通路慢性激活和细胞转移之间的联系。除了需要加剧染色体异质性作为自然选择的底物外，还需要持续的染色体错误分离来提供细胞质DNA并维持促转移状态。因此，即使是高度非整倍体细胞，抑制CIN也可以减少细胞转移。STING激活的影响是依赖于上下传导通路的协调激活。

由于染色体不稳定细胞存在大量的细胞质DNA，正常的炎症反应恢复为靶向染色体不稳定细胞提供了可行的治疗策略。

CIN的出现及随后的耐受性是肿瘤演化过程中的一个重要节点。研究人员发现CIN诱导肿瘤细胞从高度代谢状态向间充质状态转录移位。转移瘤的泛基因组分析发现的这两种互斥的细胞状态解释了肿瘤形成早期染色体非整倍性的负面影响。同时，该研究还揭示，CIN通过EMT和炎症驱动肿瘤的转移。

参考文献：

[1] Samuel F. Bakhoum,Bryan Ngo, et al. [J]. Nature, 2018,553: 467–472.

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