作者：李婷婷，南京农业大学博士在读。主要研究根际噬菌体-青枯菌共进化动态。
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进化是永恒的话题，在微生物的进化中，基因水平转移和突变是主要的两个驱动因素，使得细菌能够适应不断变化的环境压力。CRISPR系统就是一种利用插入基因元件进化的免疫系统。CRISPR系统使用RNA引导的核酸酶介导水平基因转移可移动遗传元件（例如结合质粒和噬菌体）的基因组序列特异性破坏，从而限制了细菌通过该机制进化。CRISPR系统的一个亚群也表现出DNA的非特异性降解，但是尚未研究此功能是否能够影响以及如何影响宿主。该研究发现，葡萄球菌的III-A型CRISPR-Cas系统的非特异性DNA酶活性增加了宿主的突变，并加速了金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗生素耐药性的产生。这些突变需要诱导SOS对DNA损伤的反应，并表现出独特的模式。这些结果表明，通过差异影响产生遗传多样性的两种机制，III-A型CRISPR系统可以调节细菌宿主的进化。
III-A型CRISPR-Cas免疫反应增加了突变水平
CRISPR-Cas系统一般有六种分型（I–VI），大部分的细菌中含有的是III 型CRISPR–Cas系统，该系统除了对入侵的基因序列切割之外，也可能会攻击宿主的基因造成宿主染色体损伤。如果不能及时修复，将导致宿主细胞的突变。本研究就此展开，首先，文章测试了针对质粒结合的免疫是否可以诱导突变。试验材料是包含pG0400莫匹罗星抗性质粒（或非目标pG0400对照）的金黄色葡萄球菌RN4220细胞（供体），计算了结合效率（图1a）和突变频率——利福平耐药菌落数与总菌落形成单位（CFU）计数的比率（图1b）。由于所谓的“累积效应”，抗性突变在实验过程中预先存在或早期出现并在细胞分裂过程中被放大，当针对pG0400结合触发III-A型 CRISPR-Cas免疫反应时，突变频率显著增加（图1b）。试验接下来利用缺失CRISPR基因座和原噬菌体的金黄色葡萄球菌检验了针对噬菌体感染的III-A型反应是否也导致了突变水平的增加。实验表明插入的两种含有CRISPR的质粒 (pCRISPR) 都表现出对 噬菌体ϕNM1γ6 感染的有效防御（图1c）。相对于未被侵染的处理，携带III-A型而非II-A型CRISPR-Cas系统的感染培养物显示出突变频率的显著增加（图1d）。总之，这些结果表明III-A型CRISPR-Cas免疫反应增加了突变水平。
图1 III-A型CRISPR-Cas免疫增加了葡萄球菌的诱变文章进一步研究了在降解DNA的能力方面具有功能丧失或功能获得突变的葡萄球菌，以确定组件Cas10的ssDNase 活性是否可增加这种突变。试验表明，在针对ϕNM1γ6的III-A型免疫期间ssDNase活性增强，与野生型葡萄球菌相比，这种细胞的突变频率在统计学上显著增加（图2a）。接下来，研究分析了表达核酸酶缺陷型Cas10 (dcas10) 的细胞中的诱变，其中Csm6提供抗噬菌体的免疫，并发现其对抗生素的抗性与被噬菌体侵染的处理无显著差异（图2a）。同样，在侵染少于1,000个细胞的实验中，dcas10突变显著降低了。最后，dcas10突变还消除了在用ϕNM1γ6侵染大约109个细胞后靶向的晚期表达基因gp43的突变频率增加。
图2 诱变过程中需要诱导Cas10ssDNase活性和SOS反应III-A型CRISPR-Cas的诱变使葡萄球菌能够适应不同的选择环境
这种突变由何而来？试验检测到即使没有噬菌体激活，具有野生型III-A CRISPR-Cas基因座的培养物的突变率仍有增加。在没有噬菌体侵染的情况下，dcas10突变的存在导致突变频率和速率的（如果有的话）降低，从而具有加剧的Cas10核酸酶活性的 dcsm3/dcsm6突变体显著增加。在表皮葡萄球菌中进一步分析了这一发现，发现野生型菌株RP62a的突变率高于同基因ΔCRISPR突变体。这些结果表明，III-A 型CRISPR-Cas基因座的唯一存在对宿主具有轻度致突变性。接下来，试验研究了III-A型CRISPR-Cas免疫诱导的诱变是否会导致对不同类型选择压力的适应。我们检查了对三类不同抗生素的耐药频率：庆大霉素（图3a）、万古霉素（图3b）和左氧氟沙星（图3c）。研究发现，相对于未处理的对照，通过Cas10复合物的激活，在ϕNM1γ6侵染中存活下来的金黄色葡萄球菌显示出对所有三种药物的抗性频率增加。与之前的结果一致，这种抗性激增在dcsm3和dcsm6等位基因存在的情况下被放大，而在dcas10突变体、依赖II-A型免疫在ϕNM1γ6感染中存活的细胞中或在无法触发SOS响应的细胞中不存在（图3e）。总之，这些结果表明III-A型诱导的诱变使葡萄球菌能够适应不同的选择性环境。
图3 诱变增加了宿主对不同类别抗生素和噬菌体的抵抗力
最后，文章研究了III-A型介导的诱变随时间的影响。每天用ϕNM1γ6 (MOI = 1) 生长、稀释和侵染处理，持续24天（大约160代），每6天在含有抗生素的平板上接种细胞，以确定随时间推移的突变频率。测试了野生型和 dcas10/dcsm3 处理（每个重复五次），在实验过程中它们显示出相似的总CFU计数。尽管突变频率值显示波动，但Cas10的存在持续增加，但核酸酶缺陷突变体则不然（图4a）。为了测量随时间累积的所有突变，从18次传代后收集的培养物中提取DNA并对其进行DNA测序以估计每个测序碱基对的突变数量，这与利福平耐药频率的增加一致，大约是在dcas10存在下观察到的频率的两倍（图4b）。这两个结果都表明，随着时间的推移，低水平的噬菌体暴露和Cas10 核酸酶的激活会导致突变的积累。
图4 III-A型CRISPR-Cas系统可在较长时间范围内诱导诱变
CRISPR-Cas系统在传统研究中通常局限在免疫功能的验证，本文从另一个角度展示了CRISPR-Cas系统的无限可能。文中许多葡萄球菌属包含III-A型CRISPR-Cas系统，其主要功能是保护宿主免受寄生元素的侵害。然而，由于葡萄球菌分别依赖质粒和噬菌体水平转移抗生素抗性基因和毒力因子，因此III-A型免疫也可以限制这些生物的进化。结果表明，这些系统可以通过非特异性诱变促进适应性和抗菌素耐药性来潜在抵消这种限制。尽管试验仅检测到突变率增加了2到3倍，但众所周知，弱或中等突变表型就可以极大地促进抗生素抗性细菌的发展。数据还表明，这种突变机制在长期上可能对葡萄球菌的进化产生重大影响，甚至可能超出抗生素耐药性的产生。值得注意的是，这些系统也进化出，以增加宿主的突变率，并促进其适应的不断变化的环境和新的噬菌体威胁能力。这样打破传统思路的研究，也能够帮我在今后实验中面对传统研究方法时，更新分析思路，更好突破传统实验范畴的局限，做出一些有趣的新发现。论文信息
原名：Type III-A CRISPR immunity promotes mutagenesis of staphylococci
译名：III-A型CRISPR免疫促进葡萄球菌的突变
期刊：Nature
发表时间：2021.04
通讯作者：Luciano A. Marraffini
通讯作者单位：洛克菲勒大学
