中山大学附属肿瘤医院周宁宁教授联合吉因加揭示手术切除小细胞肺癌的肿瘤内异质性
导读
肺癌是全球最常见的癌症，其中小细胞肺癌是恶性程度最高的一种类型，具有进展快、转移早、易复发等特点，约占新发肺癌总人数的15%左右。对于小细胞肺癌患者，过去几十年里传统治疗方式（化疗、放疗等）并没有显著进展。尽管绝大多数患者在初次治疗时对化疗和放疗敏感，但最后都不可避免地会面临着化疗耐药和疾病进展的困境。对于这种难治性恶性肿瘤，如何改善患者预后是当下的研究重点。既往研究提示肿瘤内异质性可能会导致治疗失败，化疗可增加广泛期小细胞肺癌瘤内异质性，与化疗耐药息息相关。而由于未经治疗的局限期小细胞肺癌标本有限，目前我们尚不清楚此类肿瘤的肿瘤内异质性。
近日，中山大学附属肿瘤医院周宁宁教授联合吉因加基因研究院，利用多区域全外显子测序技术全面揭示了小细胞肺癌（SCLC）的肿瘤突变负荷、瘤内异质性、进化和潜在生物标志物，旨在提供手术切除SCLC的肿瘤内异质性图谱。全文《Multi-region exome sequencing reveals the intratumoral heterogeneity of surgically resected small cell lung cancer》刊发于Nature Communications杂志（IF = 14.919，中科院1区Top期刊）。
主要发现
该研究团队对来自于40例手术切除SCLC患者的120份肿瘤样本进行了多区域全外显子测序研究，综合分析其体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤纯度、新生抗原和肿瘤内异质性（ITH）等内容。结果发现，最常见的突变基因是TP53和RB1，基于体细胞突变和拷贝数变异数据，均可观察到中等程度的瘤内异质性。就突变分布、ITH、肿瘤突变负荷（TMB）、克隆进化和基因特征而言，复合型小细胞肺癌（C-SCLC）患者的表现与单纯型小细胞肺癌（P-SCLC）患者大致相同，类似的情况也出现在吸烟与未吸烟组；EGFR突变与野生型组。每个克隆中的TMB（TMB/Clone）越高，无疾病生存率越高，而体细胞突变ITH（SNV ITH）与总生存率负相关，上述指标有望作为SCLC的预后生物标志物。
研究结果
01
病人特征
研究队列包括40例手术切除SCLC患者，其中包含6例为复合型小细胞肺癌。表1显示了患者的临床特征。患者年龄中位数为62岁。大多数患者为男性（35，87.5%），有吸烟史（31，77.5%）。所有患者均接受了手术治疗，肿瘤大小平均为22.5mm。约65%的患者在术后接受进一步治疗。中位随访时间中位数为22.82个月。
表格1.小细胞肺癌队列临床信息
02
基因突变情况
研究团队对120份SCLC FFPE样本（每位患者3个区域）进行多区域外显子组测序（MRS）。结果显示，共检测到33,153个非沉默体细胞突变；最常见的突变基因是TP53（88%）和RB1（72%），均为主克隆突变；LRP1B（22%）、PCLO（15%）和KMT2D（15%）为亚克隆突变；年龄、BRCA1/2、烟草和黄曲霉毒素相关突变特征是主要突变的特征（图1a）。基于基因突变分布数据可观察到SCLC患者SNV存在显著差异（图1b），亚克隆突变占比范围在17%-100%之间（图1c），SNV ITH水平处于中等水平，与TRACERx研究中涉及的NSCLC数据无显著差异。
03
拷贝数变异情况
SCLC体细胞拷贝数变异（CNV）主要包括1号、12号、18号、19号、20号、3p、5p、6p和8q染色体的扩增及4号、10号、3p、5q、13q、15q、16q、17q、21p和11q染色体的缺失（图2a）。显著扩增的区域包括1p34.2 (HEYL), 1q21.3 (APH1A), 2p24.3 (MYCN), 3q29 (PIK3CA), 5p13.2 (IL7R), 6p22.3 (E2F3), 8q24.21 (MYC) and 9p24.1 (CD274, PDCD1LG2)；显著缺失的区域包括3p12.1,4q13.2, 5q35.3, 9q21.11(CBWD3), 10q23.31 (PTEN), 13q14.2 (RB1), 14q11.2, 15q25.3 (NTRK3), 19p12 (ZNF429), and 22q11.1 (图2b-c)。基于CNV数据评估的瘤内异质性水平（CNV ITH）的中位数为0.485（图2d）。
04
克隆进化和通路富集
研究团队利用多区域检测到的体细胞突变数据构建系统发育树。图3a按疾病分期分组展示了每个患者的系统发育树（图3a）。其中，TP53、EGFR和CREBBP等基因突变是参与SCLC进化的常见早期克隆事件（图3b），而RB1和其他突变是晚期克隆事件。
05
与临床特征之间的相关性
研究人员发现ITH与其他临床变量（包括病理、吸烟史、EGFR突变状态和肿瘤分期）之间无显著相关性（图4a-b）;P-SCLC及C-SCLC、吸烟者及非吸烟者和EGFR突变型及野生型患者的ITH、TMB和突变克隆数水平相似，基因特征和突变图谱也都没有显著差异（图4）。
图5a展示了该队列的临床病理信息。单因素分析发现TMB/克隆数量比值（TMB/Clone）越高，无进展生存期（DFS）越长，而SNV ITH与总生存期（OS）相关，研究并未观察到DFS、OS与TMB、CNV ITH、突变克隆数或肿瘤分期之间的相关性（图5b-c）。对年龄、肿瘤大小、肿瘤分期和吸烟状况进行校正后，多因素分析结果再次证实TMB/Clone与更长的DFS相关，SNV ITH与更差的OS相关（图5d-e）。
图5. SCLC瘤内异质性与临床特征之间的关系
研究结论
该研究通过对小细胞肺癌肿瘤样本进行多区域外显子测序研究，系统探索了ITH评分与临床病理特征之间的关系，结果发现手术切除SCLC存在中等程度的肿瘤内异质性，而且肿瘤内异质性独立于常见的临床病理特征，与病理类型、吸烟史和驱动基因突变状态无关。多因素分析发现TMB/Clone、SNV ITH与疾病复发进展和生存相关，有望作为SCLC的预后生物标志物。综上，该研究提示SCLC肿瘤内异质性广泛存在，并与治疗失败有关，后续需要进一步研究其与治疗敏感性/耐药性的关系。
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参考文献：
1. Zhou, H., Hu Y., Luo R. et al. Multi-region exome sequencing reveals the intratumoral heterogeneity of surgically resected small cell lung cancer. Nat Commun.2021 Sept.doi:10.1038/s41467-021-25787-x.
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