PROTACs的两大挑战：耐药性和毒性

癌症是严重威胁人类健康和生命的疾病，已有研究从人类超过2万种蛋白质中，筛选了600多种蛋白质，证实在各种癌症发生及进展中有重要功能，其中包括近400种非酶蛋白，使用现在占位驱动的药物开发方法，非酶的靶点多数被称之为“不可成药”的靶点。

小分子靶向蛋白质降解药物（Targeted protein degradation，TPD)的开发，最新几年取得很多进展，包括分子胶和异双功能降解药物，如蛋白质水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras，PROTACs)。通过直接降解靶蛋白，使得靶向以前被认为“不可用药”的蛋白质成为可能。异双功能降解药物，一端连接感兴趣的蛋白（protein of interest ，POI)，另外一端连接E3连接酶。

PROTACs和传统占位驱动药物开发模式的差异（Current Opinion in Chemical Biology 2019, 50:111–119）

但是和所有的药物开发技术类似，PROTACs也存在着不小的挑战。比如E3连接酶配体的缺乏，以及肿瘤突变等进化的耐药性，以及非特异性作用引起的毒性等。

耐药性

PROTACs降解药物对E3连接酶的依赖，肿瘤细胞通过损害E3连接酶成分功能，来产生耐药性。事实上，研究证明，在长时间治疗后，肿瘤细胞获得了对VHL招募和CRBN招募PROTACs的耐药性。

对PROTACs的获得性抗性主要是由基因组的改变或CRBN基因或CUL2基因的表达显著减少引起的，而不是针对参与结合POI和E3连接酶的残基的点突变。CRBN的基因组缺失也被发现是骨髓瘤细胞对IMiDs产生抵抗的主要原因。

耐药细胞CUL2基因突变或者删除（Mol. Cancer Ther. 18, 1302–1311 (2019).

基于三种不同E3连接酶CRL2V^CHL、CRL4^CRBN和CRL4^DCAF15的全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选显示，CRBN、VHL和DCAF15的缺失介导了对PROTAC耐药性。研究提示，肿瘤通过介导其非必需E3连接酶的突变，获得对于PROTAC的耐药。使用RNAi研究，8种用于PROTAC的E3连接酶，至少5种对于肿瘤细胞功能是非必需的。

研究显示，对于CRBN-PROTACs和VHL-PROTAC耐药的基因改变没有重叠，因而交替使用招募不同E3连接酶的PROTACs可能是克服耐药的途径之一。

毒性

药物毒性是限制治疗药物有效性的主要因素。在TPD领域，免疫调节性亚胺药物（immunomodulatory imide drugs IMiDs）的毒性是一个值得关注的问题。Thalidomide在20世纪50年代末获得批准治疗多发性骨髓瘤，但在发现它导致广泛（超过1万）严重的出生缺陷后被禁止，此外还可以引起过敏性皮疹，中性粒细胞减少和心律失常。

一些毒性作用被认为是由IMiDs介导的CRBN新底物(neosubstrates)降解引起的。MDM2配体如nutlin3最初通过抑制MDM2-p53的相互作用被发现为MDM2拮抗剂和p53激活剂。虽然临床前研究和早期临床试验表明nutlin3治疗癌症的疗效，但其p53在正常细胞中p53激活导致的剂量限制靶毒性，仍然是推进nutlin3作为单一治疗药物的重大挑战。

磺胺类药物是DCAF15配体，可诱导RNA剪接因子如RBM39的降解，RBM39在许多细胞类型中是必不可少的；与此一致的是，在临床试验中观察到剂量限制毒性。

然而，BIRC2配体bestatin和RNF114配体nimbolide在临床应用中似乎都具有低毒性和相对积极的安全性。鉴于目前E3配体的缺乏及其局限性，TPD领域迫切需要开发具有低毒性的新型E3配体。

E3连接酶的新底物

虽然没有VHL的新底物的报道，但许多IMiD-CRBN复合物的新底物已被报道，其中许多含有乙炔锌指脱基序。翻译终止因子GSPT1可能是最令人担忧的新底物，由于GSPT1在大多数细胞中起关键作用，因此GSPT1可能被招募CRBN的PROTACs降解，有潜在的毒性。

首次有报道称GSPT1被MI-389（CRBN招募的PROTAC，泛激酶抑制剂sunitinib作为POI结合剂）无意中降解，而预期的靶点KIT没有被降解。由于GSPT1在翻译中的关键作用，通过CRBN招募的PROTAC降解GSPT1可能导致POI的降解作为次要效应。据报道，CRBN招募PROTACs可以降解其他CRBN新底物。例如，CDK4和CDK6 PROTACs可以降解淋巴样转录因子IKZF1和IKZF3，这是CRBN招募IMiDs的两种新底物，在杀死套细胞淋巴瘤细胞方面的效果明显高于单独降解CDK4和CDK6。因此，确定CRBN招募PROTACs的新底物降解谱是至关重要的，以排除次级药物反应。

此外，DCAF15和DDB1-CDK12的新底物RBM39和CyclinK分别在许多细胞类型中都是必不可少的；因此，确定DCAF15招募和DDB1-CDK12招募PROTACs的新底物降解谱是很重要的。

小编总结

作为“不可成药” 靶点的希望，PROTACs最近两年获得了较大进展，也受到了资本市场的关注。当然除了众所周知的优势，PROTACs也存在一些挑战，比如耐药性和毒性。PROTACs的耐药主要是E3连接酶及相关基因的表达下降或者删除引起，而毒性主要是因为E3连接酶作用于新的底物，降解了其他分子，引起不可控的副作用。

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