干货分享 | 新型递送载体实现治疗性基因编辑

迄今为止，CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用因递送方式而受到限制。Cas9蛋白是一个非常大的分子（~160 kDa），且gRNA的长磷酸骨干带高度负电荷，这些特征阻碍了其通过细胞膜进入细胞。

人们已经探索了许多不同的方法来解决这个问题，包括病毒、质粒、mRNA和蛋白质传递方法，如图1所示。

图1. Cas9递送方式^[1]

在金斯瑞首届基因与细胞工程峰会上，加州大学伯克利分校的Niren Murthy教授分享了高效且安全的CRISPR/Cas9基因编辑工具在体内传递策略。

首先，Murthy博士讨论了一些目前已经开发的病毒和非病毒方法，如AAV、电穿孔和LNPs等（如图1）。虽然病毒载体提供了有效的方式来传递CRISPR/Cas9和基因，但也有一些缺点，特别是Cas9表达的扩展可能会导致不良的免疫反应和不必要的脱靶DNA切割。

一般而言，非病毒方法（如质粒、mRNA、RNP）传递CRISPR/Cas9编辑工具的效率较低，Murthy博士强调，肝脏是一个例外，在肝脏非病毒传递方式非常有效。

为了解决目前在体内传递CRISPR/Cas9的局限性，Murthy博士的团队开发了一种被称为CRISPR-Gold的递送策略，如图2所示，CRISPR-Gold由结合到供体DNA模板的金纳米颗粒组成，与Cas9 RNP复合，并被聚合物包裹。

这种方法在单个粒子中提供了基因编辑所需的所有成分，Murthy博士团队和GenEdit公司的研究人员成功地修复了杜氏肌肉营养不良模式小鼠体内的抗肌萎缩蛋白基因突变，相关研究结果发表在Nature Biomedical Engineering期刊上，您也可以通过观看视频了解更多实验数据。

图2. CRISPR-Gold组成^[2]

目前，Murthy博士正在与GenEdit合作继续发展这个项目。此外，他还与GenEdit合作开发基于CRISPR-Gold的大脑基因编辑策略。

在Murthy博士演讲的最后一部分，他介绍了另一种递送方式——DEC liner。

DEC是一种新型的还原敏感连接剂，可以修饰脂肪族胺并以无痕的方式释放它们（图3）。DEC能够通过细胞穿透肽（Arg ₁₀）的PEG可逆地修饰CRISPR–Cas9上的赖氨酸残基或供体DNA，并生成明显改善的Cas9偶联物。

值得一提的是，Cas9–DEC–PEG能够比未修饰的Cas9更好地在脑组织中扩散，这使其更适合用于动物体内基因组编辑。此外，将细胞穿透肽（Arg ₁₀）与DEC结合至Cas9能够产生自递送Cas9 RNP，无需编辑转染试剂即可编辑细胞。

图3. DEC组成及作用方式^[3]

参考文献：

1. Glass Z, Lee M, Li Y, et al. Engineering the delivery system for CRISPR-based genome editing[J]. Trends in biotechnology, 2018, 36(2): 173-185.

2. Lee, Kunwoo, et al. 'Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair.' Nature biomedical engineering 1.11 (2017): 889-901.

3. He, Maomao, et al. 'A traceless linker for aliphatic amines that rapidly and quantitatively fragments after reduction.' Chemical science 11.33 (2020): 8973-8980.

来源：金斯瑞生物