一种利用外泌体递送siRNA至小鼠大脑的方法
今天为大家推荐一个几年前的研究工作，没有给大家介绍过但是很重要。大家都知道，由于其生物相容性好等优点，外泌体这种天然的膜泡在药物尤其是大分子的递送方面具有很好的应用前景。但是天然外泌体的靶向性其实并不怎么好，有很多小伙伴告诉他们提取的外泌体主要聚集在了肝脏上。要将其如何改造才能达到很好的药物递送效果呢？这篇2011年发在Nature biotechnology (IF=41.667)上的研究工作虽然有点老，但相信能给尚未关注到该工作的朋友们带来些帮助。
由于临床转化的障碍越来越明显，最近RNA干扰（RNAi）的热度降低了很多。在这些障碍之中，最重要的一个是递送—— 以治疗剂量将RNAi试剂（如siRNA）靶向特定组织的能力。在这个问题上，Alvarez-Erviti等在2011年提出通过利用人体自身的细胞间传递RNA的载体来递送siRNA。具体说就是，通过在外泌体表面表达神经元靶向蛋白，装载siRNA后将它们注射到小鼠的血液中，它们可在大脑中实现特定的基因敲低。外泌体作为siRNA载体的使用虽然还处于早期阶段，但可能是大分子药物递送领域的重大进展，并且可能是siRNA临床应用的关键步骤。
图 :利用外泌体、病毒、脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒递送siRNA的优缺点比较
目前，对治疗性RNAi的研究集中在三类递送载体上：病毒、聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）纳米颗粒和脂质体。这三类都取得了一些成功，特别是在肝脏中诱导RNAi。尽管如此，在期望的靶组织中实现临床有效的基因沉默，同时避免免疫激活和毒性还远远没有做到。病毒可以通过将shRNA表达基因整合到基因组中来介导长期的基因沉默，并且可以通过设计使其具有特定的组织倾向性，但是它们具有很多重大缺点。在血液中，病毒可能会被已存在的抗体清除，并且会激活补体或凝血因子。它们还会诱导阻止重复施用的中和抗体应答。通过插入突变使靶细胞中的基因表达失调是主要的安全问题，并且一些病毒仅在分裂细胞中整合。
合成载体系统（如PEI纳米颗粒、脂质体或脂质纳米颗粒）可防止siRNA在血流中降解，并可使其携带靶向成分。然而，PEI-RNA复合物在肝脏、肺脏、脾脏和肾脏中积累，限制了其在其他组织中的应用。通过PEI的“质子海绵”效应实现了粒子内吞后siRNA的细胞质递送，这导致了胞内体破裂。从近期的工作中我们知道，任何内体或溶酶体膜的破裂或泄漏都会释放组织蛋白酶B，导致与IL-1诱导和细胞凋亡相关的炎症小体激活，从而排除了体内长期使用PEI的可能性。
目前脂质是siRNA递送的优选方法，已经优先实现肝脏的有效递送。尽管如此，肝毒性仍然是一个严重的问题。脂质纳米颗粒也被用于将siRNA递送至小鼠的不同实体瘤。脂质体或脂质纳米颗粒吸附调理素，激活补体和凝血因子，并由于它们的净电荷和大小而导致单核吞噬细胞系统的吞噬作用。脂质纳米颗粒也依赖于内吞作用，原则上所有通过胞吞作用递送的物质都必须逃离胞内体进入胞质溶胶才能发挥作用。与PEI一样，这一过程可导致细胞应激、炎症小体激活和细胞凋亡。
鉴于病毒和合成系统的局限性，从自然界需找天然的载体系统或许可以解决这些问题。外泌体是天然细胞间通讯系统。1983年，在绵羊网织红细胞成熟过程中追踪转铁蛋白受体再循环的实验过程中首次被发现外泌体。它们是直径为50-100nm的膜囊泡，并且在体外被大多数细胞类型分泌。外泌体是胞内体来源的，源自多泡小体的膜内陷，并在多泡小体与质膜融合时释放到细胞外环境。虽然关于外泌体功能仍然存在许多问题，但是已知它们可以在细胞间转移mRNA、miRNA、受体和酶来影响邻近细胞的功能，并且它们参与免疫应答的交流。
以前只有一项研究应用了外泌体进行药物递送（这里指文献发表当年——2011年，现在已经有很多相关研究了），使用它们将小分子抗炎药物靶向免疫细胞。随着他们在这个问题上的研究，Alvarez-Erviti等首先用这种方法递送大分子药物。他们从未成熟的小鼠树突状细胞制备外泌体，未成熟的树突细胞被设计为表达外泌体膜蛋白Lamp2b和组织靶向肽的融合物。siRNA通过电穿孔加载到外泌体中。在体外对递送siRNA的外泌体进行仔细表征之后，作者在体内展示了注射到循环中的携带神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的外泌体将siRNA递送到小鼠脑神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。为了显示其方法的治疗潜力，他们递送针对BACE1的siRNA，所述BACE1介导β-淀粉状蛋白斑块的形成并且与阿尔茨海默氏病发病机理相关。外泌体靶向递送siRNA的BACE1抑制导致野生型小鼠的脑β-淀粉样蛋白水平显著降低。
治疗神经疾病的难题是血脑屏障，只允许<400道尔顿的脂溶性分子自发扩散。这可以防止约98％的药物、核酸和外泌体自发定位到大脑。RVG靶向烟碱型乙酰胆碱受体的α-7-亚基，可能促进外泌体穿过血脑屏障。乙酰胆碱受体除了在神经元和脑毛细血管中的存在之外，在神经肌肉连接处也是丰富的。作者通过RVG-外泌体不显著影响培养的鼠C2C12肌肉细胞，但是可在体外和体内靶向鼠Neuro2神经元来说明其靶向特异性。
虽然Alvarez-Erviti等对外泌体的免疫原性进行了初步研究，但还需要进行更多的工作。作者证实，通过RVG靶向脑的外泌体不诱导体内短期先天性免疫活化，如诱导IL-6、IP-10、TNF-α或IFN-α。他们还发现在体外混合淋巴细胞试验中使用来自同系或同种异体小鼠的细胞，在3天内没有T细胞增殖的增加。但他们没有研究RVG-Lamp2b融合蛋白是否诱导重复给药后的适应性免疫。事实上，很可能会产生适应性免疫反应。另一个未被研究者解决的问题是，受阿尔茨海默病影响的大脑中，用于使外泌体靶向大脑的RVG的受体，即α-7-亚基乙酰胆碱受体，明显减少。这个问题在开发包含抗BACE1 siRNA的RVG-外泌体用于阿尔茨海默氏病的临床时是最重要的。最后，值得考虑的是，长时间治疗患者需要大量自体单核细胞，必须通过白细胞分离术获得所需数量的树突细胞。相信今后的研究肯定会解决这些问题和其他问题吧。
参考文献：
1. Alvarez-Erviti, L., et al. (2011). "Delivery ofsiRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes." Nat Biotechnol29(4): 341-345. IF=41.667
2. van den Boorn, J. G., et al. (2011). "SiRNA deliverywith exosome nanoparticles." Nat Biotechnol 29(4): 325-326. IF=41.667
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