科研 | Chemosphere:多种类芘降解菌筛选方法-引入易降解多环芳烃(国人作品)
编译:曾军,编辑:小菌菌、江舜尧。
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芘(四环)降解菌对于研究高分子量多环芳烃的生物降解过程具有重要意义。常规筛选方法效率低下,多仅能获取分枝杆菌等个别菌属。
本研究以期改进传统方法从而获取多种类芘降解菌。研究基本原理为多环芳烃微生物共降解原理,拟通过引入易降解菲提高芘降解菌筛选效率。实验通过不同方案的比较、两轮次的验证明确出有效的筛选方法。研究发现只需在平板筛选步骤中更改筛选底物,即可显著提高芘降解菌筛选效率。
论文ID
原名:Isolation of diverse pyrene-degrading bacteriavia introducing readily utilized phenanthrene.
译名:多种类芘降解菌筛选方法-引入易降解多环芳烃
期刊:Chemosphere
IF:5.108
发表时间:2019
作者:曾军、朱清禾、李艳杰、戴叶亮、吴宇澄等
通讯作者:林先贵
作者单位:中国科学院南京土壤研究所
前言
多环芳烃是一类环境中广泛存在的具有“三致”效应的有机污染物,其中高环种类(≥4环)难以生物降解。研究表明,细菌可有效矿化4环及以下的多环芳烃,而难以利用5环及以上的种类。芘是高环多环芳烃生物降解的模式污染物,芘降解菌能够降解2到5环等多种类多环芳烃,是研究高环多环芳烃降解特征和途经的良好对象。分枝杆菌是最普遍也最早被分离的芘降解菌。针对该降解菌近40年的研究,使得研究者在高环多环芳烃生物降解特征、途经、基因、生态等诸多领域都取得了深入认识。
实验设计
1.传统筛选与改进方案
传统筛选包括采样-富集-平板初筛-液体培养复筛等四个步骤,在芘降解菌筛选过程中,传统方法采用芘为筛选底物贯穿始终。
改进方法需要在传统步骤中引入菲,共设计了2个改进方案:其中M2是将富集步骤的芘替换为菲,M3则是在平板初筛中将底物芘进行替换。此外,研究加入了传统的芘降解菌(M1)和菲降解菌(M4)的筛选进行对照比较(表1)。
2.方法设计与分析项目
筛选共进行了两轮实验:第一轮采用两处不同地理位置的污染土壤用于获取有效的筛选方法,第二轮重新采集了一处污染土壤,对优化方案进行验证。
分析项目包括降解菌的分类学鉴定(16S rRNA基因比对),污染物降解特征(唯一碳源、共代谢),和遗传稳定性(无压力条件传代)。
结果
1 获取有效的筛选方法
第一轮的筛选过程,考虑到不同土壤可能筛选出不同的PAH降解菌,因此使用了来自不同地理位置(一处来自南京、一处来自上海)的两个土样。研究发现,尽管采用不同土样,传统方法(M1)和改进方法M2只能筛选出单一种类分枝杆菌(NS4)。相比之下,方法M3获得了更多样化的降解菌(分别命名为NS2,NS5和NS6)。但意外的是,M3却没有筛选出分枝杆菌。M4分离得到一株菲降解菌NS7,用于比较不同降解菌对多环芳烃的降解差异(图1a)。
为了验证M3的有效性,第二轮筛选采集了另一处土壤(来自南京的另一处)进行筛选。采用新方法,又额外获得了三株形态不同的菌株,命名为NK2,NK5和NK6,新方法依然没有筛选出分枝杆菌(图1a)。
这八个形态上不同的菌株与七个属有关,他们分属于放线菌门,变形菌门和厚壁菌门。NS2为博西菌属,NS4为分枝杆菌属,NS5为节杆菌属,NS6为类芽孢菌属,NK2和NK5属于芽孢菌属,NK6属于红球菌属。菲降解菌NS7属于鞘脂菌属(图1b)。
2 降解菌对多环芳烃的降解
降解实验比较了降解菌在平板和液体培养基上对污染物的降解,并比较了唯一碳源和共代谢条件下的降解特征。
结果发现,在芘平板上博西菌NS2和分枝杆菌NS4可降解平板上的污染物,菲降解菌NS7能够观察到微弱的水解圈,而其他筛选菌并未在芘平板上形成明显水解圈;然而,在液体复筛中发现,降解菌在液体培养条件的降解并非与固体平板表现一致。所有历经芘选择压力的降解菌,均可在液体培养基中对芘产生较高效的降解。同时,这些降解菌在共代谢的条件下,还显著提高了对五环苯并[a]芘的降解效果。同等条件下,菲降解菌NS7对芘的降解效率明显差了许多(图2)。
通过无选择压力培养基评估菌株降解能力的遗传稳定性。结果表明,分枝杆菌属NS2,节杆菌属NS5,芽孢杆菌属NK2和NK5的降解能力比较稳定,而博西菌NS2、类芽孢菌属NS6和红球菌属NK6的降解能力容易丧失(图3)。
结论
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