科研 | EM封面文章：多组学揭示了野生蘑菇“羊肚菌”实现人工栽培的生理生态机制(国人作品)
编译：TH，编辑：小菌菌、江舜尧。
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羊肚菌是一种外形奇特却十分美味的蘑菇，是与松露（块菌）、牛肝菌齐名的名贵食用菌，因其子实体呈蜂窝状，形似羊肚而得名。羊肚菌曾经长期无法人工栽培，只能靠采集野生羊肚菌供应市场。1882年法国人开始尝试驯化栽培羊肚菌，但始终未能成功。20世纪80年代美国人Ronald D. Ower发明了一种技术，据称其核心原理是“使羊肚菌从营养丰富条件转变到营养匮乏条件，促进营养生长向生殖生长转变”，实现了羊肚菌室内栽培出菇，并取得了发明专利，但Ower意外身故后没有人能用Ower公布的方法重现羊肚菌的出菇。近二十年来，中国食用菌从业者受Ower专利思路启发，开发了一种“外源营养袋”，让羊肚菌在普通农田大棚中大量出菇，并优选了容易出菇的菌株作为栽培品种，使得羊肚菌大规模商业化栽培产业从无到有，逐渐成熟稳定。营养袋主要由麦粒、谷壳组成，装在聚丙烯袋子中（图1a），灭菌后放置在已经接种了羊肚菌菌种的农田土壤表面（图1b）。土壤中的羊肚菌菌丝从袋底的扎孔中生长进营养袋中，分解利用袋中的营养。营养袋中的营养被消耗后逐渐干瘪，而羊肚菌的子实体从土壤中破土而出（图2）。这种栽培蘑菇的方式目前为羊肚菌所独有，非常不同于平菇、香菇、金针菇等常见食用菌从装满木屑、棉籽壳、玉米芯等富含木质纤维素（lignocellulose）的菌袋中直接出菇的形式（图1c）。营养袋是羊肚菌人工栽培技术的关键之一，但是为何采用营养袋就能使羊肚菌从土壤中长出子实体，尚未清楚，相关科学原理的认知落后于技术应用，制约了技术的进一步发展完善。
论文ID
原名：Multi-omic analyses of exogenous nutrient bag decomposition by the black morel Morchella importuna reveal sustained carbon acquisition and transferring
译名：黑色羊肚菌Morchella importuna分解营养袋的多层次组学分析揭示持续性的碳营养获取与转移
期刊：Environmental Microbiology
IF：5.147
发表时间：2019.10（封面文章）
通信作者：谭昊&Francis Martin
通信作者单位：四川省农业科学院&法国国家农业研究院
实验设计
图1 (A)羊肚菌栽培使用的营养袋；(B)羊肚菌大规模商业化栽培场景；(C)羊肚菌利用营养和出菇的方式与常见食用菌如平菇的区别
图2 在农田土壤中播种羊肚菌、放置营养袋和出菇收获的过程简图
结果
1.梯棱羊肚菌全基因组分析
商业化人工栽培羊肚菌M. importuna SCYDJ1-A1和法国野生菌株M. importuna CCBAS932两个菌株之间的基因组共线性程度较高。SCYDJ1-A1菌株和CCBAS932菌株分别有11971和11600个基因，其中核心基因分别有9891和9873个。这9891和9873个核心基因中有9783个在两个菌株之间相同，其中包括所有的CAZymes基因。大多数的菌株特异性基因编码的是没有明确功能的小分子、跨膜的蛋白，意味着梯棱羊肚菌的信号受体蛋白、表面抗原等跨膜小分子蛋白在不同菌株之间存在差异，这可能是菌株之间可交配或互斥等机制的分子基础。带有信号肽的分泌型功能蛋白如胞外降解酶等在两个菌株之间相对保守，包括用于分解利用碳源营养的CAZymes的配置也非常一致，说明梯棱羊肚菌不同菌株利用碳源营养的方式是较为一致的。相比其他近缘的盘菌类真菌，梯棱羊肚菌缺乏木质素降解相关的基因（图3），说明梯棱羊肚菌较难直接利用木头、秸秆等木质素含量较高的碳源营养原料，而是需要较容易利用的植物多糖类碳源，如纤维素等。野生羊肚菌从土壤中出菇，利用的是土壤中高度降解后的植物残体，人工栽培羊肚菌需要富含淀粉和纤维素的营养袋，与基因组CAZymes基因的分析结果一致。
2.营养袋内容物中的微生物区系演替
对细菌16S rRNA基因V4-V5片段和真菌ITS序列进行扩增子Illumina高通量测序。微生物区系构成的主成分分析表明，同一监测时间点取样的营养袋内细菌区系和真菌区系都较为一致，不同时间点之间差异较大（图4A）。假单胞菌属细菌是营养袋中细菌区系中的优势群，在开始阶段丰度最高，后期有所降低；真菌区系中羊肚菌在开始阶段占有优势，后期丰度逐渐衰减，被木霉属、被孢霉属等的杂菌侵占（图4B）。说明羊肚菌菌丝对营养袋的分解作用是在有环境微生物存在的背景下进行的。
图4 (A)营养袋中细菌区系与真菌区系构成的主成分分析。(B)细菌和真菌微生物区系在属的水平OTU组成的变化
3.宏转录组、宏蛋白质组中梯棱羊肚菌的CAZymes表达
为寻找梯棱羊肚菌分解利用营养袋过程的关键CAZymes基因，以对营养袋放置到长有羊肚菌菌丝的土壤表面后第15天、第45天和第75天的营养袋中羊肚菌菌丝的基因转录和酶蛋白水平进行了比较，以第15天、第45天和第75天分别作为前期、中期、后期的代表。宏蛋白质组中，总共检测到1380个来自真菌的蛋白。第45天与第15天相比，有570个蛋白上调表达，804个表达水平接近，6个下调表达；第75天与第45天相比，有122个蛋白上调表达，1162个蛋白表达水平接近，96个下调表达。宏蛋白质组的1380个蛋白中，有833个属于梯棱羊肚菌。第45天与第15天相比，有168个梯棱羊肚菌的蛋白上调表达，660个表达水平接近，5个下调表达；第75天与第45天相比，有5个梯棱羊肚菌的蛋白上调表达，740个表达水平接近，88个下调表达。梯棱羊肚菌基因组中360个CAZymes基因中，有88个出现在了营养袋宏蛋白质组中，其中主要CAZymes如图5所示。总体而言，梯棱羊肚菌CAZymes基因的转录高峰在前期和中期，酶蛋白存在量的高峰在中期和后期。这些CAZymes主要包括分解淀粉、纤维素、半纤维素、果胶和脂类等碳源营养的酶。其中分解纤维素和半纤维素的酶种类较多。木质素降解酶中只有1个AA1_3家族的类漆酶多铜过氧化物酶（LMCO）基因。
图5 营养袋中梯棱羊肚菌主要CAZymes的表达水平变化
4.CAZymes活性水平和营养袋内容物的分解消耗
对放置到土壤表面后第15、45、75天的营养袋中各种分解酶的活性高低进行了测量（图6）。营养袋中γ-淀粉酶（又称糖化酶，glycoamylase）活性最高，远高于α-淀粉酶和β-淀粉酶。高活性的γ-淀粉酶是由一个GH15家族酶基因编码的（图5）。纤维素酶和半纤维素酶的活性不如淀粉酶高。营养袋中脂酶的活性比较高，但是以麦粒和谷壳为主要原料的营养袋内容物本身脂类含量并不高。大多数酶的活性按照15、45、75天的顺序逐渐升高，与蛋白质组中酶基因表达蛋白的趋势一致。可见营养袋中降解碳源有机营养的酶主要是淀粉酶、纤维素酶等。为印证，对营养袋中有机质成分的变化进行了化学检测（表1）。从第0天到第75天，营养袋的干重大约下降了一半，其中的总碳含量也大约下降了一半，总氮含量却无显著变化，导致碳氮比从接近37:1下降到18:1。碳源物质中，消耗最多的是淀粉、纤维素等碳水化合物。在初始状态，支链淀粉的量几乎是直链淀粉的两倍。经过75天的分解消耗，支链淀粉被分解消耗了一大半，直链淀粉几乎全被分解消耗掉，说明淀粉是营养袋中供给羊肚菌的主要碳源营养物质，印证了淀粉酶是羊肚菌分解营养袋中碳源营养的关键酶。纤维素也有较大程度的分解消耗，是由图5中显示的多种GH家族的纤维素酶在一起合力完成。脂类在前中期出现积累，后期被消耗，印证了脂酶的高活性，这是富余的碳源营养被羊肚菌转化为脂类暂存在营养袋中，到了后期再被消耗利用。木质素的含量和相关降解酶的活性水平都比较低。
图6 营养袋中酶活性变化
5 羊肚菌分解利用营养袋对土壤碳氮及最终收获子实体产量的影响
营养袋向土壤供给了大量的碳源营养。从第15天到45天，是土壤表层有机碳含量增加幅度最大的阶段，从第45天到第75天临近出菇时土壤有机碳含量也在继续增加。如果提前撤走营养袋，土壤有机碳增加的趋势也会停止。说明营养袋对土壤的碳供给是持续性的，与营养袋中有机碳营养被大量消耗相对应。虽然营养袋中羊肚菌菌丝所处环境的营养含量逐渐下降，但是直接产生子实体的土壤羊肚菌菌丝所处环境的碳源营养供应和储备却越来越多，与Ower的专利技术中表述的“使羊肚菌从营养丰富条件转变到营养匮乏条件，促进营养生长向生殖生长转变”的核心思路并不相同。
土壤总氮和铵态氮含量并未显著增加，相反在营养袋放置的最初15天还有少量下降。这是高碳氮比的营养袋内容物争夺土壤中氮素营养所致。为分解营养袋中丰富的淀粉、纤维素、半纤维素、果胶等碳源有机质，羊肚菌菌丝需要制造大量的分解酶。酶是蛋白质，由氨基酸组成，其制造过程需要大量氮元素作为原料，这与最初15天营养袋中总氮含量不降反升相对应。为验证这一现象，用氮15同位素进行标记试验，验证发现土壤中的氮15部分进入营养袋中并富集到胞外蛋白中。这一发现刷新了食用菌业界以往关于营养袋向羊肚菌既供给大量碳、又供给大量氮的猜想，揭示了羊肚菌人工栽培出菇技术中碳营养主要来自营养袋，氮营养主要来自土壤。
羊肚菌对营养袋的分解利用决定着羊肚菌出菇产量的高低。本次试验中，土壤表面不摆放营养袋（即留置0天）的试验处理中没有收获到任何羊肚菌子实体。营养袋仅留置15天的处理中，羊肚菌子实体产量极低，每平方米仅有7.78克干重，换算成亩产鲜重不到60斤。营养袋留置45天的处理中，最终收获羊肚菌子实体50.97克干重每平方米，折合亩产鲜重接近400斤。留置75天，则每平方米收获子实体77.27克干重，折合亩产鲜重超过550斤，达到梯棱羊肚菌大面积种植的普遍正常亩产水平。说明营养袋的作用是持续性的，从第15天后开始发挥明显作用，45天之后仍然具有提高羊肚菌产量的作用，直到75天仍然有效。与前面揭示的，营养袋有机碳营养的分解高峰在第15天以后，以及高通量组学揭示的羊肚菌CAZymes基因在第45-75天表达水平较高的趋势均吻合，进一步印证了羊肚菌分解利用营养袋中的有机碳等营养物质后，是运输到土壤表层，供出菇使用，营养袋中的营养被利用越多，最终收获的羊肚菌子实体产量越高。
结论
图7 结论示意图
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