科研 | ISME：儿童克罗恩患者粪便胆汁酸与微生物组群落结构之间的关系
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
肠道微生物组的群落结构与克罗恩病（CD）的发展及其对治疗后的反应息息紧密相关。胆汁酸（BAs）在调节肠道免疫反应中发挥着核心作用，而肠道菌群的变化对肠道胆汁酸的改变影响巨大。本文调查了儿童克罗恩患者粪便样品中肠道微生物群与粪便胆汁酸之间的关系，研究者发现对于专有肠内营养诱导治疗后症状缓解但不能维持的儿童克罗恩患者，其粪便样品中的胆汁酸组成发生了变化，且与初级胆汁酸和次级胆汁酸含量相关的微生物群落结构截然不同。另外，粪便中胆汁酸的浓度与不同分类群细菌的丰度度相关。最后，具有初级胆汁酸优势的样品与脱羟基化酶的群落水平降低有关。
论文ID
原名：The relationship between fecal bile acids and microbiome community structure in pediatric Crohn’s disease
译名：小儿克罗恩病中粪便胆汁酸与微生物组群落结构的关系
期刊：The ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019.12
通讯作者：Johan Van Limbergen
作者单位：加拿大达尔豪斯大学儿科部
实验设计
结果
1 患者特征及其对专有肠内营养（EEN）诱导治疗的响应
图1. 根据EEN诱导治疗后临床反应分组的CD患者样本中的粪便胆汁酸浓度分析。a. EEN治疗后症状缓解的13名患者分别在基线时间点和12周后的加权PCDAI得分。b. EEN治疗后症状缓解的13名患者中病情复发百分比的生存率图。c. SR，NSR和NR患者粪便样品中priBA和secBA分别所占的百分比。d.SR，NSR和NR患者粪便样品中BA总量的绝对浓度。e.SR，NSR和NR患者样品中priBA的百分比。***p<0.001
2 不能通过EEN诱导治疗缓解的克罗恩疾病（CD）患者中的一个亚组中粪便胆汁酸（BA）组成发生了改变
研究者分析了表1中所述的来自17名CD患者的57份粪便样品中的粪便BA组成与经EEN诱导后结果之间的关系。根据每个样品中鉴定到的初级胆汁酸（priBA）和次级胆汁酸（priBA）所占百分比确定了分别属于NSR和NR组患者的不同亚组样品，其中priBA占粪便BA总量的70%以上（图1c）。两个样品（1个NSR和1个NR）几乎全部由共轭的priBA组成（图1c）。值得注意的是，从六分之五的NSR患者得到的19个样品中有11个（57.9%）能够观察到priBA占优势，但在SR患者的任何样本中均未观察到priBA（0/26）（p<0.0001，Fisher精确检验NSR与SR样品之间priBA的显著特征）。SR、NSR和NR组样品之间的总粪便BA浓度均无显著差异（图1d）。在EEN诱导治疗之前收集的所有可用的NSR患者样本均具有priBA占优势的显著特征，且priBA的百分比要显著高于SR患者中的样本（p<0.001），这表明后期会复发的患者在接受EEN治疗之前就存在粪便BA偏高的特性（图1e）。而SR患者在EEN治疗之前、期间或之后均未检测到priBA占优势的样品（图1e）。
3 PriBA优势样本与分类学多样性的降低有关
研究者使用16S rRNA扩增子数据（V4V5）及基于MetaPhlAn2评估的宏基因组中选择分类学的标记基因分析了来自11个priBA优势样品、44个secBA优势样品的细菌序列数据（总共57个样品，排除了2个细菌序列数量较少的共轭BA样品）。基于16SrRNA数据分析鉴定了1445个（平均值227±85）OTUs，而宏基因组序列分析鉴定出209个（平均值37±13）OTUs。priBA优势和secBA优势群落整体表现出鲜明的特征：priBA优势样本展现出α多样性的降低（Chao-1 p < 0.001和Shannonindex p < 0.01）（图2a）同时在β多样性分析图中呈现聚集状态（图2b）。
图2. priBA-和secBA-优势样本中鉴定的OTUs的α多样性图（Chao 1 and Shannon指数）（a）和β多样性图（PCA）（b）。c.箱线图展示了在非参数Mann–Whitney U检验下，priBA-和secBA-优势样本中Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria菌属分类群的相对丰度。d. 在BioMico分析中鉴定的集合与OTUs后续分布的群落水平关系网。集合中鉴定出占优势的OTUs使用虚线相连。圆的直径表示集合中OUT的后验概率（PP）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001
4 不同的微生物群落结构与priBA-/secBA-占优势的粪便BA分布有关
在门的水平上，研究者发现priBA优势样品中Proteobacteria的丰度明显更高（p < 0.05, Mann–Whitney U检验,FDR < 0.05）（图2c）。
为了更好地了解与priBA-和secBA-优势样本相关的细菌群落结构之间的差异，研究者利用BioMiCo贝叶斯建模框架来分析类群之间的共现关系。利用16S数据，BioMiCo鉴定了三个组合（A1、A2、A3），其中一个（A1）与priBA优势样品有关，另外两种（A2和A3）与secBA优势样品有关（图2d）。priBA优势样品组合中的主要分类群是Bacteroides（包括B.plebeius）、Enterobacteriaceae、Roseburia、Ruminococcusgnavus 和 Megamonas，而secBA优势样品组合中发现的主要分类群是不同的Bacteroides（包括B.uniformis）、Ruminococcaceae、Erysipelotrichaceae、Rikenellaceae和Lachnospiraceae（图2d）。
宏基因组类群数据（其获得的OTUs数量与16SrRNA序列分析相比更少，约小于其总数的20%）通过BioMiCo分析，确定了13个组合。其中，有两个组合与priBA优势样品有关，其后验概率（PP）分别>0.60、>0.15。这些priBA优势样品组合包含多个属于Bacteroides的类群（包括B.plebeius、B. ovatus、B.dorei和 B. thetaiotaomicron），以及Ruminococcus gnavus、Escherichiacoli、Clostridium bolteae和Veillonella的几个种群。9个组合与secBA优势样品有关。其每个组合都具有较低的PP（<0.1），但合起来大致确定了分布规律的0.75，并且也包含不同的Bacteroides类群，包括B. vulgatus和Buniformis，以及Faecalibacterium、Subdoligranulum和Alistipes的几个种群。
研究者使用Kruskal–Wallis检验并通过多重检验（Benjimini–Hochberg）校正，进一步比较了priBA-和secBA-优势样本中分类群的相对丰度。利用错误发现率（FDR）阈值<0.05同时基于16S OUTs的分配，研究者在priBA优势样品中确定了9个OUTs，其相对丰度明显更高，在secBA优势样品中也确定了9个OTUs较高。基于宏基因组类群分配的平行分析发现，在priBA优势样品中有24个类群（FDR<0.05）具有较高的相对丰度，而在secBA优势样品中有16个类群具有较高的相对丰度。这些分析结果在priBA优势样品组合中鉴定出许多与16S分析结果相同的分类单元，包括B. plebeius和Megamonas（Veillonellaceae）的几种菌种，同时secBA优势样品组合中包括Lachnospiraceae、Rikenellaceae和Ruminococcoceae。
5 粪便BA浓度与不同细菌分类群的丰度有关
使用斯皮尔曼相关性来探讨粪便中priBA和secBA代谢物浓度与细菌分类群丰富度之间的关系。利用16S OUT数据，研究者发现总共有195个FDR-显著（q<0.05）相关。其中主要的priBAs胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA），与属于Proteobacteria（尤其是Enterobacteriaceae）的分类群高度相关（图3a）。相比之下，主要的secBAs石胆酸（LCA）和去氧胆酸（DCA），与大多数属于Firmicutes（Ruminococcaceae和Lachnospiraceae）的OTUs相关。有趣的是，几个次要的secBAs，包括熊去氧胆酸（UDCA）和两个通常在人类粪便中无法检测到的BA——猪去氧胆酸（HDCA）和β-巯基酸（β-MCA），它们与许多priBA相关的分类群相关。具体而言，UDCA和HDCA与Veillonelladispar、Bifidobacterium、B.plebeius以及Streptococcus、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Enterobacteriaceae和Clostridiales的OUTs正相关（图3a）。
图3. 热图展示了基于16S-（a）和宏基因组序列分析（b）鉴定样品中存在大于5%的微生物分类群与粪便BA代谢物之间的Spearman相关性。Benjimini Hochberg用于校正多项测试以确定其重要性。c. 来自16SrRNA数据的OUT数量和来自宏基因组数据的分类群与Actinobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes和Proteobacteria中鉴定的BA代谢物相关。
6 PriBA优势样品与编码BA 7α-脱羟基但不早期解离的酶基因序列的菌群水平降低有关
肝脏中产生的priBAs与牛磺酸或甘氨酸结合，必需通过细菌的胆酸水解酶（BSH）进行早期解离，才能够在结肠中进一步代谢为secBAs。priBA优势样品中未缀合（unconj）与缀合（conj）BA的比例与secBA优势样品中的相当，这表明早期解离作用并不会受到影响（图4a）。与此相符的是，检查早期解离BA所需基因（bsh（K01442））的宏基因组序列数据，确实发现在priBA-和secBA优势样品之间，bsh序列的相对丰度没有显著差异（图4b）。总的来说，53个样品中（10个priBA-和43个secBA占优势），有36个不同的分类群（属于Actinobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes），以及一个未分类的类群对bsh有帮助。在分别来自priBA-和secBA优势组合的两个样本中，研究者并没有检测到任何bsh。
图4. a. priBA-和secBA-优势样本中未缀合BA代谢物与缀合BA代谢物之间的比率。b.priBA-和secBA-优势样本中胆汁酸水解酶基因（bsh）序列的相对丰度。c.priBA-和secBA-优势样本中来自已鉴定分类群且包含bsh基因样品的百分比。
样本组之间在对bsh起作用的分类群上有显著差异。secBA优势样本包含有助于bsh的分类群数量是priBA优势样本的两倍（分别是35 VS 16）。使用Mann–Whitney检验，研究者发现Bacteroidetes中的Alistipes（A.finegoldii p=0.0027，A. onderdonkii p= 0.011和A.shahii p=0.015）、Ruminococcus obeum（p=0.015）和Firmicutes中的Faecalibacterium prausnitzii（p=0.003）在secBA优势样本对bsh的贡献显著大于priBA优势样本。对bsh有贡献的F. prausnitzii在secBA优势样本中达到32/43，而在priBA优势样本仅有1/10。相反，在priBA优势样本中R.gnavus（Firmicutes）（10/10）是一个最普遍的bsh贡献者，与secBA优势样本中的情况相比，其丰度明显更高（p=0.013）。
接着检查宏基因组序列中是否存在参与非缀合priBA转化为secBA的基因，包括7α-HSDH(hdhA，K00076)的基因，以及bai操纵子上的七个基因：baiB (K15868)，baiA (K15869)，baiCD (K15870)，baiF (K15871)，baiE(K15872)，baiH (K15873)和baiI (K15874)。
讨论
这项研究首次探讨了粪便BA概况和肠道菌群结构与小儿CD患者经全肠内营养治疗后效果（包括持续缓解和复发）之间的相关性。研究者发现经EEN治疗后未缓解的部分患者（NSR组）中，出现了以priBAs为主的粪便BA分布。值得注意的是，这种priBA优势分布情况在EEN治疗前采集的样品中最为显著。相反，在EEN治疗后达到并持续缓解的患者（SR）样本中仅以secBA为主。
在先前的研究中就发现粪便中secBA浓度降低与炎症性肠病（IBD）以及肝硬化和非酒精性脂肪肝有关。由于secBA的形成完全是由肠道菌群通过早期解离和脱羟基化的分布式途径介导的，所以肠道菌群失调会严重影响肠道中priBA向secBA的转化。据报道，缺乏BSH酶的肠道微生物群落具有催化早期解离反应途径的能力，但其形成secBA的可能性比较低。确实，先前的研究表明，IBD患者的BSH基因丰度和活性的降低与粪便中secBA的含量低和共轭BA的水平高有关。研究者分析表明，priBA优势样品相关微生物组具有与secBA优势样品相当的BA解偶联能力。但是，在priBA优势样品中检测到的对bsh基因有贡献的分类群更少，这很可能反映了样品总体多样性的降低。虽然BSH具有保守的功能，可以在有利环境中通过去除共轭BA来促进细菌的生长，但仍有待观察的是，priBA优势样品中观察到的多样性降低现象是否会降低这种功能的鲁棒性，并且使患者更容易出现BA代谢异常的现象。
研究者的分析表明，priBA优势样品中secBA合成的主要限制在7α-脱羟基的活性。CA和CDCA的7α-脱羟基分别形成DCA和LCA，这主要由存在bai表达基因的Clostridiales菌属的一组限制性细菌来完成，其中包括Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Blautia。与对照组相比，肝硬化患者（尤其是晚期肝硬化患者）体内Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Blautia菌属的丰度与7α-脱羟基的能力相关。在一个粪便微生物移植（FMT）的研究当中，Brown等人发现Coprococcus、Faecalibacterium、Ruminococcus和Ruminococcaeae等菌属与粪便中secBA的水平呈正相关。与先前的研究结果一致的是，在本研究的样品中secBAs DCA和LCA与这些分类群也呈现出显著正相关。但是，在序列分析的基础上，研究者仅在少于25%的样品中鉴定出bai基因。bai基因恢复的缺乏可能是因为本文研究群体中发现的编码这些基因的分类群基因注释并不完整（几种Clostridium、Eggerthella和几种Lachnospiraceae）。Eggerthella是Actinobacteria菌属的成员，它们在先前的研究中被证明可以表达7α-脱羟基以及其它BA修饰的相关基因，包括DCA和LCA的同分异构体。研究者在一个对人类微生物组宏基因组数据的调查中发现，bai基因的恢复水平与本研究中的发现比较相似。
有趣的是，priBA优势样本中通常水平较低的粪便secBA（包括UDCA和HDCA）浓度提高了。实际上，HDCA通常被认为并不是人类的BA，仅能在人类粪便中检测到微量。据报道UDCA在结肠中具有保护作用，包括抑制结肠上皮细胞释放促炎性细胞因子，从而防止实验性结肠炎中结肠炎症的发展。UDCA是由CDCA通过7α-和7β-HSDH酶的连续反应形成。本研究的宏基因组学分析确定了priBA优势样本比secBA优势样本中具有更多编码7α-HSDH（hdhA）的基因，表明其与UDCA的产生直接相关。而7β-HSDH的相关注释很少，并没有被检测到。priBA优势样本中的hdhA基因主要是由R.gnavus.衍生而来。据报道Ruminococcus物种同时具有UDCA产生所需的7α-和7β-HSDH酶活。UDCA可以通过细菌的7α-脱羟基作用进一步代谢为LCA。值得注意的是，LCA在结肠中表现出比UDCA更有效的抗炎症活性，并且还抑制T1辅助应答，这表明由UDCA的微生物代谢衍生而来的LCA有助于其保护作用的发挥。相关性分析显示，UDCA和Veillonella、Streptococcus和Enterobacteriaceae之间存在强烈的正相关性，同时原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者口服UDCA后其体内的这些菌属也增加了，这表明UDCA本身可能作用于微生物群落以诱导其特征性的变化。
利用贝叶斯推理及Kruskal–Wallis检验分析肠道菌群的结构，研究者确定了priBA-和secBA-优势样本中分类群的差异。在priBA优势样本中，主要的OTUs来自Veillonellaceae家族（Veillonella和Megamonas）以及Enterobacteriaceae。在肝硬化患者体内菌群中也观察到Enterobacteriaceae和Veillonellaceae的富集，而priBA向secBA的转化却减少了。Enterobacteriaceae对BAs具有高度耐受性，在CD/IBD患者中已多次观察到包括Enterobacteriaceae在内的潜在致病共生体或“病菌”的扩增，且它们被认为可能引发或加剧过于活跃的免疫反应以及随之而来具有疾病特征的组织损害。同样，R. gnavus是priBA优势样本中BSH和7β-HSDH的主要来源，也被认为是IBD患者（尤其是病情加重的患者）的致病菌。据报道secBA比priBA具有更强的杀菌活性，这可能有助于priBA优势样本中病原体的扩增。在本研究中，作者无法测量样品中细菌的绝对数目，因此目前尚不清楚priBA优势样品是否也与细菌的过度生长相关。
评论
克罗恩病是炎症性肠病的主要形式，是一种复发和缓解疾病。而微生物修饰的胆汁酸在炎症性肠病的病理生理过程中起着重要作用。专有肠内营养（EEN）已经是国际上公认的儿童克罗恩病的一线诱导疗法，但治疗后仍会存在患者症状无法持续缓解症状，这可能与患者的某些微生物特征有关。本研究使用16S rRNA扩增子数据和宏基因组序列分析等方法鉴定了经EEN治疗后症状缓解及病情复发的儿童克罗恩患者粪便微生物群落结构与粪便胆汁酸之间的关系，从而为临床上开发出基于微生物组的新干预治疗措施提供了新的思路。
你可能还喜欢
这些或许也适合你哦👇