科研 | Science：微生物源性肌苷调节检查点抑制免疫治疗的反应
编译：依然，编辑：小菌菌、江舜尧。
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有几种肠道细菌与检查点阻断免疫治疗的增强效果有关，但微生物增强抗肿瘤免疫的潜在机制尚不清楚。
本文分离出三种细菌，包括Bifidobacteriumpseudolongum、Lactobacillus johnsoni和Olsenella species，它们在四种小鼠癌症模型中显著增强免疫检查点抑制剂的效力。本文发现B.pseudolongum通过产生代谢物肌苷来调节增强的免疫治疗反应。免疫治疗引起的肠道屏障功能下降增加了肌苷的系统转运和抗肿瘤T细胞的活化。肌苷的作用依赖于T细胞表达的腺苷A2A受体，并需要共刺激。总之，本文研究确定了一种新的微生物代谢物免疫途径，它被免疫疗法激活，可用于开发基于微生物的辅助疗法。
论文ID
原名：Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy
译名：微生物源性肌苷调节检查点抑制免疫治疗的反应
期刊：Science
IF：41.845
发表时间：2020.08
通讯作者：Kathy D. McCoy
作者单位：加拿大卡尔加里大学
实验设计
结果
免疫检查点阻断（ICB）疗法可以利用免疫系统的治疗潜力，对某些肿瘤和某些癌症患者是一种有效的治疗方法。以细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）为靶点，程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）或其配体（PD-L1）已经彻底改变了一些癌症的治疗方法，包括黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌。然而，许多其他癌症显示出对ICB治疗的原发性抗药性，并且应答率仍然很低，甚至在ICB治疗有益处的那些癌症患者之间也存在差异。因此，迫切需要确定这种不作出反应的根本原因。最近的研究提供了强有力的证据表明肠道微生物群可以影响抗肿瘤免疫，肠道微生物群的组成甚至可以预测ICB治疗的疗效。一系列研究表明，ICB治疗的疗效依赖于特定的肠道细菌，使用ICB促进细菌治疗可能有助于克服ICB治疗的原发性耐药性。尽管发现特定的细菌种类与增强抗肿瘤免疫有关，但这些微生物增强ICB治疗的确切分子机制仍然不清楚。在本研究中，利用大肠癌（CRC）的动物模型来鉴定特定的促进ICB的细菌，阐明这些微生物如何增强ICB治疗的疗效潜在的分子机制，并在膀胱癌和黑色素瘤的其他模型中验证本文的发现。
虽然肠道微生物群可以影响大肠癌的进展，并可能改变化疗的疗效，但临床上，ICB疗法在大多数大肠癌病例中是众所周知的无效的，而且微生物群在无反应性中的作用尚未确定。因此，本文研究了ICB疗法在小鼠模型中的疗效，该模型使用偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠肿瘤（图1A）。值得注意的是，抗CTLA-4或抗PD-L1抗体的治疗导致肿瘤明显减少和变小（图1、B和C），并降低了肿瘤中EpCam+Lgr5+细胞的频率，这是上皮细胞干细胞的标志物（图1D）。抗CTLA-4治疗还导致免疫细胞浸润到肿瘤中（图1E）。肿瘤引流淋巴结中的CD8+T细胞频率增加，脾脏中的IFNγ+ CD4+和IFN CD8γ+ T细胞增加。在这个模型中，当使用相同剂量的抗体时，抗CTLA-4的作用比抗PD-L1诱导的效果更大。抗CTLA-4和抗PD-L1疗效的差异可能取决于剂量-效应关系，以前曾描述过抗PD1治疗的高剂量。并且，CTLA-4和anti-PD1/PD-L1依赖于不同的机制，其中调节性T细胞和Treg的组成和功能在不同的癌症类型和肠道肿瘤中是不同的。接下来，本文使用这个模型系统来筛选与ICB反应相关的潜在有益细菌。尽管ICB治疗组和对照组小鼠的粪便细菌组成（β-多样性）没有明显变化，但少数细菌家族数量却有差异。相比之下，肿瘤相关细菌群落的测序显示多样性的差异，并且在ICB治疗的肿瘤中，其他细菌属的数量也不同地丰富（图1F）。因此，本文对两组的均质化肿瘤进行厌氧培养，能够培养和鉴定出21个不同的细菌菌株。仅从ICB治疗的肿瘤中培养出7种细菌，而对照组仅发现4种细菌（图1G）。值得注意的是，Bifidobacteriumpseudolongum是仅从ICB治疗的肿瘤中培养出来的菌株之一。B. pseudolongum经测序鉴定其丰度差异较大（图1F）。有趣的是，最近被证实能增强抗PD-L1和抗PD-1治疗肺癌和肾癌的疗效的Akkermansia muciniphila也是仅从ICB治疗的肿瘤中培养的七种细菌之一（图1G）。分离和鉴定与ICB反应性相关的不同细菌种类为本文提供了一个机会来确定所涉及的分子机制。
接下来，确定ICB治疗大肠癌的疗效是否依赖于微生物群，正如其他肿瘤类型所显示的那样。由于在微生物群有限的动物体内，原位腺癌的发生率严重降低，本文改用异位体内大肠癌模型，将MC38大肠癌细胞植入无菌（GF）或特异性无致病性（SPF）小鼠的侧腹，一旦肿瘤可触知，随后进行ICB治疗。与GF小鼠相比，抗CTLA-4治疗导致肿瘤更小，并显著增加SPF中肿瘤内和脾脏CD4+和CD8+ T细胞的活化和增殖。为了确保ICB疗效的缺乏不仅仅是GF小鼠不成熟免疫系统的反映，我们还评估了ICB治疗在抗生素治疗的SPF小鼠中的效果。与GF小鼠相似，广谱抗生素也降低了荷瘤SPF小鼠的ICB治疗效果。
为了评估在ICB治疗小鼠的肿瘤中富集的分离细菌（图1G）是否能够提高ICB治疗的疗效，用五种不同的分离细菌对GF小鼠进行单克隆。将MC38肿瘤细胞异位注射到单克隆体内或GF小鼠，在可触知肿瘤发生后，所有小鼠均接受抗CTLA-4治疗，并评估肿瘤生长和抗肿瘤免疫（图1H）。在五种细菌中，单殖B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii (L.johnsonii)和 Olsenellaspecies与GF小鼠或大肠杆菌属或普雷维菌属单克隆小鼠相比，抗CTLA-4治疗的疗效显著增强(图.1, I and J)。此外，在B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella种单克隆动物的肿瘤中，CD4+和CD8+ T细胞活化显著增加（图1K），而肿瘤内CD8 T细胞的增殖略有增加。与大肠葡聚糖菌种控制菌相比，分离的促进ICB的B.pseudolongum在MC38异位肿瘤模型中也提高了抗PDL1治疗的疗效，尽管程度低于抗CTLA-4治疗（相同剂量）的观察结果，类似于我们在AOM/DSS模型中的观察结果。值得注意的是，其他双歧杆菌，如短双歧杆菌和长双歧杆菌，以前在小鼠黑色素瘤模型中被发现能促进抗肿瘤免疫和增强抗PD-L1的效力。在人类中，长双歧杆菌被报道富含抗PD1应答者。此外，B.pseudolongum广泛分布在哺乳动物的肠道中，许多不同的菌株表现出基因组多样性和不同的代谢能力，这表明它们的功能依赖于菌株。
本文发现抗肿瘤免疫依赖于ICB治疗，因为在没有抗CTLA-4治疗的情况下，B. pseudolongum的单克隆化不能减少肿瘤生长或诱导抗肿瘤免疫，这与以前对其他促生ICB细菌的研究相似。重要的是，尽管先前的研究表明，一些细菌在肿瘤环境中积聚，在那里它们局部刺激免疫系统并通过有毒代谢物杀死肿瘤细胞，但无法在异位肿瘤中检测到B. pseudolongum。因此，尽管B. pseudolongum最初是从肠道肿瘤中分离出来的，但在模型中，肿瘤内的细菌并不需要增强ICB治疗，这表明可溶性因子可能参与其中。
虽然B. pseudolongum在没有ICB治疗的情况下不能诱导抗肿瘤免疫，但是肠道假长双歧杆菌诱导小肠固有层CD4+T细胞中Th1主转录调节因子T-bet的表达显著增加，在GF或大肠杆菌属单克隆小鼠中未观察到这种情况（图2，A和B）。这说明B. pseudolongum即使在没有ICB的情况下也具有免疫调节能力。由于缺乏ICB，这种影响仅限于肠道相关淋巴组织（GALT），因为在肠系膜淋巴结（MLN）中也观察到，尽管程度较低，但在脾脏中没有（图2C）。在没有ICB的情况下，假长毛B不会增加Th1细胞的效应器功能的激活，因为IFN-γT+-bet+细胞与任何评估组织中的对照组没有差异（图2、B和C）。总之，在没有肿瘤和ICB治疗的情况下，假长双歧杆菌促进GALT中Th1的转录分化，而不会增加肠道和引流淋巴结的效应器功能。虽然B.pseudolongum对小肠中的其他CD4+T细胞亚群没有影响，但它确实增加了CD8+T-bet+T细胞。此外，B. pseudolongum对MLN和脾脏的Th17和调节性T（Treg）细胞的影响很小。
由于B. pseudolongum在没有肿瘤的情况下的单克隆化和ICB治疗在体内平衡期间只诱导局部粘膜Th1分化，接下来探讨B.pseudolongum和抗CTLA-4治疗（在没有肿瘤的情况下）是否会导致全身Th1活化。事实上，B. pseudolongum定植联合ICB治疗可显著增强脾脏Th1细胞的激活和效应器功能，与大肠葡聚糖菌单克隆或GF动物相比，IFN-的产生证明了这一点（图2、D和E）。结论是B.pseudolongum诱导Th1分化，并与抗CTLA-4一起激活Th1效应T细胞。有趣的是，最近定义的由11种细菌组成的联合体（不包括任何双歧杆菌属）在没有免疫治疗的情况下优先诱导CD8+T细胞产生IFN-并促进抗肿瘤免疫。相反，B. pseudolongum诱导CD4+和CD8+T细胞产生干扰素，抗肿瘤免疫需要ICB治疗。
本文对B. pseudolongum诱导Th1转录分化的能力和ICB治疗后Th1效应器功能激活的能力感兴趣。胃肠道炎症是抗CTLA-4治疗常见的免疫相关不良反应，推断这可能是由于肠道屏障完整性的改变。事实上，与对照组相比，用anti-CTLA-4治疗的单克隆动物表现出增加的全身血清抗共栖抗体反应性，特别是Th1相关的IgG2b，并且小肠经皮电阻降低。尽管进行了全身性或全身性炎症治疗，但没有引起明显的局部炎症。在这方面，有趣的是，一些双歧杆菌已经被报道为抗CTLA-4诱导的小肠结肠炎提供保护，而不影响肿瘤生长。ICB治疗后的系统性抗细菌抗体的诱导没有作为抗CTLA-4治疗的ICB促进作用所需的对B细胞和抗体缺乏的B. pseudolongum单克隆小鼠也有效。因此，由于细菌不在（异位）肿瘤中积聚，抗CTLA-4降低了肠道屏障的完整性，B.pseudolongum的ICB促进作用不需要B细胞和抗共生抗体，假设代谢物的系统性转位增加可能是导致假长双歧杆菌在ICB治疗期间的全身效应的原因。为解决这一问题，从携带肿瘤的GF、B.pseudolongum或大肠杆菌属单克隆小鼠中收集的血清经抗CTLA-4治疗后与抗CTLA4一起转移到GF MC38荷瘤小鼠中（图2F）。值得注意的是，来自抗CTLA-4处理的B.pseudolongum单克隆小鼠的血清，但不来自抗CTLA-4处理的GF或大肠杆菌属单克隆小鼠的血清，足以减少肿瘤生长，并在GF小鼠的肿瘤和脾脏中激发强的抗肿瘤免疫（图2，G至I）。综上所述，这些数据表明，由B. pseudolongum或诱导的可溶性因子对观察到的ICB促进作用负责。
血清样本的非靶向代谢组学显示，与单克隆C.sp.和GF小鼠相比，B. pseudolongum血清中的几种代谢物水平增加（图2J）。值得注意的是，嘌呤代谢物肌苷是唯一的代谢物，与Colidextribacter或GF小鼠的血清相比，B.pseudolongum小鼠的血清中含量明显更高（8至9倍）（图2K）。值得注意的是，黄嘌呤和次黄嘌呤（肌苷的降解产物）在A. muciniphila小鼠的血清中也升高。对细菌培养上清液的分析表明，B.pseudolongum和A. muciniphila产生的肌苷明显高于Colidextribacter。在相同的培养条件下，揭示肌苷是由B. pseudolongum和A. muciniphila产生的细菌代谢物。相反，虽然L.johnsonii不产生肌苷，但与大肠葡聚糖菌相比，它确实产生了大量的次黄嘌呤，一种与肌苷结合在同一受体上的有效配体。值得注意的是，一磷酸肌苷和次黄嘌呤是在小鼠盲肠和血清中含量最高的两种代谢产物。最近发现可以改善ICB疗法。肌苷的同一性通过碎片分析得到证实。
为了测定肌苷在体内的生理水平，测定了B. pseudolongum单克隆小鼠十二指肠、空肠和盲肠中的肌苷含量。肌苷在十二指肠最高，沿胃肠道逐渐降低（十二指肠66.13 ±14.23 μM > 小肠中段29.26 ± 9.38 μM> 盲肠0.5± 0.05 μM）。还定量了抗CTLA-4和抗PD-L1处理的B.pseudolongum（抗CTLA-4:26.16 ± 3.32 μM，抗PD-L1:37.5 ± 10.2 μM）和Colidextribacter的血清中肌苷浓度。（抗CTLA-4:3.26±1.01 μM，抗PD-L1:4.8 ±1.3 μM）单克隆小鼠、抗CTLA-4治疗前（4.08±1.12 μM）和抗CTLA-4治疗后（11.65 ± 2.09 μM）SPF小鼠血清和抗生素治疗的SPF小鼠血清中（2.03 ± 0.86 μM）。这些数据表明，细菌在上消化道产生肌苷很可能是B. pseudolongum小鼠体内肌苷水平升高的主要来源。
肌苷的鉴定最初令人惊讶，因为肌苷与腺苷2A受体（A2AR）结合，已证明肌苷对体外Th1分化和体内抗肿瘤免疫有抑制作用。事实上，支持腺苷和A2AR信号免疫抑制作用的数据导致了新的免疫检查点抑制剂靶点的开发，如以CD73、CD39和CD38为靶点的单克隆抗体，以及A2AR的药理拮抗剂，其中许多目前正在临床试验中。然而，一小部分文献表明肌苷类似物可以促炎，A2AR信号可以维持小鼠Th1/抗肿瘤免疫。基于这些相反的发现，研究肌苷是否可以促进Th1细胞的体外分化。将活化的OVA323-339肽脉冲骨髓源性树突状细胞（BMDCs）与OVA323-339特异性OT-II CD4+ T细胞共培养。有趣的是，肌苷在诱导或抑制CD4+Th1 T细胞分化方面的作用被证明是上下文相关的。具体地说，在外源性IFN-γ的存在下，肌苷强烈地促进了T细胞的Th1分化（图3A），而在没有IFN-γ的情况下，肌苷抑制Th1的分化（图3B）。接下来剖析肌苷促进Th1分化的分子机制。虽然A2AR信号传导的药理抑制（ZM241385）完全消除了肌苷的作用，但A2AR下游的信号分子细胞渗透性环腺苷酸（db-cAMP）的加入恢复了Th1分化，并绕过了对肌苷的需要（图3A）。进一步地，抑制蛋白激酶A（cAMP A）下游的分化（图1）。此外，肌苷-A2AR-cAMP-PKA信号级联导致转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，这是一种已知的关键Th1分化因子的转录增强剂，如IL-12受体和IFN-γ。事实上，我们还观察到了肌苷依赖的IL12Rβ2上调。
肌苷的作用是T细胞固有的，因为添加肌苷到nafiveT细胞中，即使在没有IFN-γ的情况下，抗CD3/抗CD28包衣珠激活的nafive T细胞也能促进Th1分化-γ。此外，当肌苷刺激A2AR缺陷T细胞时，没有诱导CREB的Th1分化和磷酸化。相反，通过使用db-cAMP绕过A2AR信号的需要，增加了A2AR缺陷T细胞中CREB的Th1分化和磷酸化，证实肌苷的Th1促进作用依赖于A2AR信号。此外，由于已知pCREB与关键的Th1靶基因结合，我们还证实肌苷刺激导致CD4T细胞中Il12rb2和Ifng基因表达的持续上调。重要的是，肌苷剂量反应实验显示，在B.pseudolongum（而不是大肠杆菌属）的单克隆小鼠血清中观察到的肌苷生理浓度足以诱导Th1活化。相比之下，腺苷（也与A2AR结合）仅在肠内容物中以极低的水平存在，并且B. pseudolongum和Colidextribacter单克隆小鼠的血清水平没有差异，这表明腺苷不太可能介导B.pseudolongum的ICB促进作用。此外，腺苷剂量-反应实验显示血清中的腺苷水平不足以促进Th1活化和效应器功能。为了证实肌苷介导的Th1体外促进作用是否也适用于体内条件，用卵清蛋白联合CpG作为共刺激物免疫GF小鼠。值得注意的是，利用CpG作为一种肋刺激物，因为它是一种广泛使用的抗肿瘤佐剂。一天后，小鼠腹腔注射肌苷或载体。肌苷增加了MLN中T-bet+IFN-γ+CD8+和T-bet+IFN-γ+CD4+的比例，验证了体外实验结果。
接下来，确定B.pseudolongum的ICB增强能力是否需要在T细胞上特异性地表达A2AR。在携带MC38肿瘤的B.pseudolongum单克隆Rag1缺陷小鼠中评估其抗肿瘤免疫，这些小鼠已被过继地转移到一个活性T细胞或野生型T细胞并用抗CTLA-4治疗（图3C）。我们发现在T细胞上缺乏A2AR表达降低了B.pseudolongum的ICB促进作用（图3，D和E）。
在此基础上，研究了肌苷是否能促进由CTLA-4诱导的抗肿瘤免疫。用MC38肿瘤细胞激发GF小鼠，在可触及的肿瘤上，口服或全身给予肌苷或PBS，并联合抗CTLA-4治疗和CpG作为共同刺激物（图3F）。与PBS相比，当肌苷与抗CTLA-4和CpG合用时，口服和全身给药均可降低肿瘤重量，提高抗肿瘤免疫能力（图3，G和H）。相反，在没有CpG的情况下，肌苷增加了肿瘤重量并降低了抗肿瘤免疫能力（图3，G和H），验证了先前的体外研究结果，即肌苷的作用取决于是否存在共刺激。肌苷诱导的抗肿瘤免疫也依赖于T细胞中的A2AR信号，因为口服肌苷不能诱导MC38肿瘤无生殖Rag1缺陷动物的抗肿瘤免疫，过继转移A2AR缺陷T细胞（图3，I至K）。这些数据表明，假龙须草的ICB促进作用是由肌苷介导的，并且依赖于T细胞内的A2AR信号。
由于在经ICB治疗的肿瘤中检测到A. muciniphila（图1G），并且先前被证明可以提高ICB治疗效果并在体外产生肌苷，因此进一步研究了A.muciniphila是否也依赖A2AR信号来增强ICB治疗效果。现，A.muciniphila与抗CTLA-4联合使用可导致更小的肿瘤并提高抗肿瘤免疫能力，这取决于A2AR的T细胞表达。尽管约翰逊乳杆菌的单克隆化能够促进抗TLA-4的抗肿瘤作用（图1，I到K），但次黄嘌呤（A2AR的另一个配体）在体外培养中升高，而不是肌苷。尽管如此，L.johnsonii的ICB促进作用虽然不如假长双歧杆菌和粘粘液杆菌强，但也部分依赖于A2AR的T细胞表达。
接下来测试肌苷是否也能在复杂的微生物群中促进抗CTLA-4治疗的疗效。首先利用了一种灵长类动物模型，在该模型中，小鼠被一个由12种细菌组成的微生物群稳定地定殖，称为低聚鼠-微生物群12（Oligo-MM12），该菌群缺乏B.pseudolongum。发现肌苷能够促进抗CTLA-4的抗肿瘤作用，肿瘤大小减小，肿瘤内IFN-γCD8+和IFN-γCD4 +T细胞增加，即使在Oligo-MM12小鼠中。还发现肌苷可促进SPF小鼠抗CTLA-4的效力，SPF小鼠含有高度多样的微生物群。然后我们检查假长双歧杆菌是否需要有活力来增强抗CTLA-4的效力。尽管灌胃活的B.pseudolongum，无论是否经过抗生素预处理，增强了SPF小鼠的抗CTLA-4效应，但热杀死B.pseudolongum无法增强ICB治疗的效果，可能是因为无法产生肌苷。
除了直接刺激T细胞外，肌苷还可能通过改变肿瘤细胞存活率或对T细胞介导杀伤的敏感性直接影响肿瘤细胞。然而，MC38肿瘤细胞在体外直接暴露于肌苷并不能调节肿瘤细胞的存活率，并且在与活化的肿瘤特异性T细胞共培养之前对MC38肿瘤细胞进行预处理并没有促进或抑制T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，进一步支持了抗肿瘤作用的结论肌苷主要通过T细胞介导。
这些数据表明，肌苷对T细胞的作用需要足够的共刺激（可能是由DCs）、IL12受体参与Th1分化和IFN-γ生成以获得有效的抗肿瘤免疫。事实上，与巨噬细胞相比，传统的树突状细胞（cDCs）被发现是IL-12的主要来源。为了进一步评估cDCs在ICB细菌联合治疗中的作用，将cDC-DTR小鼠的骨髓（BM）细胞转移到致死性照射的受体SPF小鼠中，以允许cDCs的诱导性、条件性耗竭。在BM重建后，用抗生素治疗小鼠，并灌胃先前鉴定的三种促ICB细菌的混合物，即B. pseudolongum, L. johnsonii和 Olsenella。10周后，将MC38细胞植入小鼠体内，当发现肿瘤时，通过注射白喉毒素和抗CTLA-4治疗消除cDCs。cDCs的耗竭导致更大的肿瘤，肿瘤内CD8+和CD4 +T细胞频率和IFN-γ生成显著降低。因此，cDC的耗竭严重降低了细菌诱导的ICB反应减少已建立肿瘤的疗效，这表明cDC需要持续的抗原递呈、IL-12的产生和T细胞的协同刺激才能有效地进行ICB治疗。cDC和IL-12在抗PD-1治疗中的重要作用已被报道。
由于增强的Th1免疫通常被认为对中回顾的大多数抗肿瘤反应是有益的，接下来确定在其他肿瘤模型中，用分离的促进ICB的细菌进行肠道定植或用肌苷治疗是否同样有效。首先，我们在SPF Msh2LoxP/LoxP-villengr动物中检测了B. pseudolongum、L. johnsonii和Olsenella对肠上皮细胞Msh2（一种DNA错配修复基因）有条件失活并在小肠发生腺癌的动物中的ICB促进作用。以前的报告显示，在临床背景下，ICB对错配修复缺陷（MMRD）癌症的疗效更高。在Msh2LoxP/LoxP-Villin-Cre模型中，仅抗CTLA-4治疗（不添加ICB促进菌）导致肿瘤重量减少，肿瘤中的EpCam +Lgr5+细胞、上皮细胞干细胞标志物、肿瘤中T细胞活化和免疫细胞浸润增加。与对照菌相比，与ICB促进菌联合治疗显著增强了抗CTLA-4的作用，导致肿瘤重量和EpCam +Lgr5+细胞进一步减少，肿瘤中的T细胞活化和免疫细胞浸润显著增强。这些结果提示细菌联合治疗可以优化MMRD肿瘤的治疗方案。值得注意的是，抗IL-12p75治疗几乎完全取消了促ICB、抗CTLA-4联合治疗Msh2LoxP/LoxP-Villin-Cre肿瘤的效果，这支持了肌苷依赖性IL-12R2上调对T细胞和cDC产生IL-12的关键作用，并证实了在同时消耗IL-12时的类似发现IL-12和IL-23，使用抗IL-12p40治疗（6，8）。由于奥沙利铂/抗PD-L1联合治疗是临床上较为常用的治疗方法，我们也证实了ICB促细菌增强了奥沙利铂/抗PD-L1联合治疗SPF-Msh2LoxP/LoxP-Villin-Cre动物的疗效。
由于B. pseudolongum在ICB治疗动物的AOM/DSS肿瘤中富集（图1，F和G），而且双歧杆菌先前与癌症患者ICB治疗效果的改善有关，想知道ICB治疗小鼠的Msh2LoxP/LoxP-Villin-Cre肿瘤中是否也富集了双歧杆菌。虽然在抗CTLA-4或抗PD-L1治疗后，肿瘤相关细菌总数没有变化，但ICB治疗导致肿瘤相关双歧杆菌的特异性富集。有趣的是，最近的一份报告显示，与其他组织相比，双歧杆菌定植于肿瘤，这可能是由于肿瘤中经常发现的缺氧环境。目前尚不清楚为什么双歧杆菌在ICB治疗条件下更倾向于这样做。
接下来，在SPF Apc2lox14/+；KrasLSL-G12D/+；Fabpl-Cre小鼠中检测B. pseudolongum、L. johnsonii和Olsenella物种对ICB的促进作用，这些小鼠具有条件性Apc缺乏和在结肠细胞中特异性激活Kras。在这个大肠癌模型中，与同型治疗的动物相比，抗CTLA-4治疗并没有提高存活率，并且ICB促进细菌的转移也未能提高存活率，这显示了该模型中细菌联合治疗的局限性。
最后，测试细菌代谢物肌苷联合共刺激是否足以提高ICB治疗其他癌症模型的疗效。在SPF Msh2LoxP/LoxP-Villin-Cre小鼠中口服肌苷与抗CTLA-4和CpG治疗可显著降低肿瘤重量，并相应增加脾脏IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8 +T细胞（图4，A至F）。重要的是，肌苷和CpG也被发现有效促进抗CTLA-4对另外两种小鼠癌症膀胱癌和黑色素瘤的疗效。具体而言，肌苷加CpG给已注射MB49小鼠膀胱癌细胞的GF小鼠能够显著增强抗CTLA-4降低肿瘤重量的能力，并增加IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8 +T细胞浸润肿瘤的比例（图4，G至K）。同样，肌苷加CpG增强了抗CTLA-4介导的黑色素瘤异位小鼠模型的抗肿瘤免疫的能力（图4，L到P）。
结论
综上所述，本文的结果确定了从经ICB治疗的结直肠癌肿瘤中分离出的B. pseudolongum是一种关键的共生肠道细菌物种，它能够促进CDC依赖的Th1细胞回路，从而大大增强ICB疗法在小鼠肠道和上皮性肿瘤模型中的效果。这些数据支持这样一个前提，即用特定的微生物联合体对微生物群或靶向细菌疗法进行改造，可能为结直肠癌和其他癌症的ICB提供一种有前途的辅助治疗。虽然从老鼠身上分离出来，但所有三种促进ICB的细菌也在人类身上发现，这表明它们有转化的潜力。此外，分析了已发表的人类粪便微生物组元基因组数据集，发现了一个趋势，尽管并不显著，B. pseudolongum的富集量高达2.4倍；与无反应的癌症患者相比，应答者的情况下。在属水平上，有反应的双歧杆菌和无反应的双歧杆菌也富集了5.9倍（尽管不显著）；B.longum和 B. adolescentis明显富集。由于在成人粪便样本中B. pseudolongum的丰度较低，需要更大样本量的更高威力的研究来证实这一趋势。还确定肌苷是一种关键的细菌衍生代谢物，通过T细胞特异性A2AR信号以上下文依赖的方式促进Th1细胞的激活。进一步证实，已知与人类对ICB治疗的反应性相关的粘蛋白A.muciniphila利用肌苷-A2AR信号传导其促进ICB的作用。根据我们的研究结果，人们可能会告诫不要阻断肌苷-A2A受体信号传导用于癌症免疫治疗，因为这可能会抵消有益微生物提供的任何积极作用。认为A2A受体信号转导可能是细菌ICB联合治疗的一个完整的抗肿瘤途径。有必要进一步研究肌苷降解产物黄嘌呤和次黄嘌呤的影响。
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