科研 | 华南农业大学范兰芬&邹记兴等：淡水和海洋养殖环境下凡纳滨对虾肠道和沉积物的微生物群比较
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由于野生捕捞渔业的下降，水产养殖在水生食物供应中扮演着越来越重要的角色。近年来，具有较高商业价值和优良养殖性能的太平洋凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）已成为中国沿海和内陆养殖的主要水生动物。然而，环境变化已成为虾疾病暴发频率增加的一个重要原因，导致虾产量显著减少。与陆生动物不同，水生动物直接暴露在水中，水产养殖系统中的细菌种群在营养吸收、水质控制、病原体防御、抗生素抵抗和维持宿主健康方面起着至关重要的作用。此外，现在人们已经认识到，肠道微生物群是一个虚拟的内分泌器官，通过充当抵御病原体入侵的屏障，并为获取宿主营养提供补充代谢途径。因此，系统比较养殖环境和虾肠道的微生物群特征对于筛选可能在水环境或虾肠中定居的益生菌至关重要。本研究采用Miseq测序技术和生物信息学方法综合分析并比较了淡水和海洋养殖环境中虾肠和沉积物的细菌群落。结果表明，在门水平上，各组样品的优势门均为Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria、Verrucomicrobia和Saccharibacteria。除海洋养殖虾的肠道外，变形杆菌是最丰富和最大的一个门，同时虾肠道可能会从附近的环境中富集放线菌。在属水平上，12个优势属中有9个在不同样品之间表现出统计学上的显著差异。此外，乳酸杆菌往往在淡水养殖虾肠道中富集，而在海洋养殖虾肠道中聚球藻菌属和弧菌极其丰富。结果表明，虾肠道和沉积物中的细菌组成相似，但细菌群落相对丰度不同。综上所述，本研究可大大提高我们对虾与沉积物之间微生物群特征的认识。为淡水养殖和海洋养殖环境下的健康养殖提供了指导。
论文ID
原名：Microbiota comparison of Pacific white shrimp intestine and sediment at freshwater and marine cultured environment
译名：淡水和海洋养殖环境下太平洋白虾肠道和沉积物的微生物群比较
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间：2019.3
通信作者：范兰芬&邹记兴
通信作者单位：华南农业大学海洋学院
实验设计
实验结果
1 16S rRNA基因测序特征
为观察淡水和海洋环境中凡纳滨对虾肠道与沉积物之间的微生物群，利用Illumina miseq平台对细菌16S rRNA基因v3-v4区进行了测序。4个组的12个样本共获得了385122个高质量序列，这些序列以97%的序列相似度聚集到3474个OTU中，每个库包含514到1523个不同的OTU。
为了说明每个样本的复杂性，计算了淡水和海洋养殖环境中所有肠道和沉积物样本的多样性和丰富度指数。香农指数从4.110821到6.316189不等，辛普森指数从0.004972到0.049179不等。利用Chao指数和ACE指数计算了各样品的丰富度。Chao指数在541.818182至1653.006098之间，而ACE指数在542.63078至1625.43153之间。样品中细菌种类的丰富度和多样性排序如下：沉积物>大肠（图1）。
图1 四组样品细菌种类的丰富度和多样性。
2 总体微生物菌群结构
所有样品中鉴定出55个原核生物门。其中相对丰度较高的为变形菌门（30.10%）、绿弯菌门（17.37%）、放线菌门（17.03%）、厚壁菌门（6.92%）、蓝藻门（6.79%）、拟杆菌门（4.84%）、酸杆菌门（3.70%）、疣微菌门（2.62%）、Saccharibacteria（1.67%）、浮霉菌门（1.43%）及其他未分类菌群（7.53%）等（图2）。
图2 所有样品中门水平细菌群落结构。
为了进一步研究淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物之间的所有样本中存在的优势微生物群，构建了Veen图来识别这四组中存在的优势OTU（图3）。PFG（淡水虾肠道样品）、PFM（淡水沉积物样品）、MSG（海水虾肠道样品）和MSM（海水沉积物样品）共有OTU为96个，占总reads数的1.85%。MSG&MSM共有OTU为542个， PFG&PFM共有OUT为738个，分别占总reads数的10.46%和14.24%。MSG&PFG和MSM&PFM共有188和281个OTU，分别占总读取量的3.63%和5.42%。
图3 四组样品OTU Veen图分析。
3 细菌种群组成差异分析
淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物的微生物群组成及聚类分析如图4所示。在观察到的55个确定的门中，4组样品中18个门的丰度为>1%。如图4所示，四组样品中的优势门（相对丰度至少在一个样品中为>5%）为Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria、Verrucomicrobia和Saccharibacteria。总体而言，四组样品优势门的组成有明显差异。然而，聚类分析将淡水和海洋养殖环境中的肠道和沉积物分类在一起，这表明虾肠道和沉积物之间的优势属组成相似（图4F）。此外，通过PCoA分析，同一环境下的肠道和沉积物样本倾向于聚集在一起（图4G），进一步证实了虾肠道细菌群落与沉积物之间的频繁相互作用。
图4 四组样品门水平微生物组成（A、B、C、D、E）及OUT水平的层次聚类分析及PCoA分析。
利用单因素方差分析，Illumina-Miseq测序数据表明，在门和属水平上，淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物中的细菌类群的相对丰度在统计学上存在显著差异（图5和图6）。在观察到的55个确定的门中，4个组中有19个门被确定存在显著差异（p<0.05）。其中Actinobacteria（Fig. 5B）、Cyanobacteria（Fig. 5C）、Bacteroidetes（Fig. 5D）和Saccharibacteria（Fig. 5E）在四组样品间存在显著差异；而Chloroflexi（Fig. 5F）Acidobacteria（Fig. 5G）表现出统计学上的极显著差异。
图5 门水平淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物中的细菌种群丰度比较
在观察到的789个属中，其中62个属在4组样品中具有显著差异（p<0.05）。优势细菌属（至少在一个样本中相对丰度>5%）中包含9个属在四组样品中具有显著差异，而Synechococcus和Lactobacillus仅在两组样品间存在显著差异。总的来说，结果表明，在淡水和海洋养殖环境中，虾肠道和沉积物的微生物组成存在显著差异。
图6 属水平淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物中的细菌种群丰度比较
4 微生物功能预测
通过PICRUSt分析了淡水和海洋养殖环境中虾肠道和沉积物微生物群的潜在功能（图7）。与种群结构图谱相比，不同分组样品的功能图谱更为相似。所有样品均富含与氨基酸转运和代谢相关的功能（相对丰度8.21%-8.54%），能量产生和转化（7.02%-7.64%），细胞壁/膜/包膜生物发生（6.19%-7.06%），信号传导机制（6.30%-6.99%）、碳水化合物转运和代谢（5.96%-6.83%）、转录（5.34%-6.97%）、复制/重组和修复（5.29%-6.08%）、无机离子转运和代谢（5.74%-5.95%）。这些COG功能分类结果表明，无论是在淡水还是海洋养殖环境中，虾肠道微生物类群都与沉积物中的微生物类群保持着相似的生物学功能。
图7 四组样品的COG功能分类分析
讨论
在过去的几十年里，全球水产养殖以惊人的速度增长。随着对优质海鲜需求的上升趋势，水产养殖必须加强发展以满足这一需求。然而，在不破坏环境和消耗自然资源的情况下，可持续生产更多的水产品仍然是一个挑战。水产养殖的可持续发展需要充分考虑环境和水生生物之间的相互作用。因此，必须制定有效的微生物生态战略，以维持虾养殖的成功生产过程，并充分了解水生生态系统中的微生物群落特征。高通量测序技术提供了对虾养殖相关微生物群的更好可视化方法。本研究采用Miseq测序技术和生物信息学方法，对淡水和海洋养殖环境中虾肠和沉积物的细菌群落进行了综合比较。本研究首次将高通量测序技术应用于淡水和海洋养殖环境中虾肠道和沉积物的微生物群。结果表明，在淡水和海洋养殖环境中，在虾肠道和沉积物中检测到具有统计学意义的不同微生物群组成和不同的细菌群落相对丰度。
以往的研究表明，在不同环境条件下，Proteobacteria、Cyanobacteria 、Tenericutes 、Fusobacteria 、Bacteroidetes 、Chloroflexi 、Firmicutes 、Acidobacteria 、Actinobacteria 、Planctomycetes 、Gemmatimonadetes和Verrucomicrobia是凡纳滨对虾（L. vannamei）的优势微生物，但在不同环境条件下，微生物种群在虾肠道和沉积物中的相对丰度是存在显著差异的。在本研究中，我们从16S rRNA基因序列中鉴定出55个原核生物门，其中Proteobacteria、Chloroflexi和Actinobacteria相对丰度较高。虽然大多数细菌类群在虾肠道和沉积物中都存在，但综合比较表明，不同样品分组中，这些细菌类群的相对丰度（门或属水平）不同。除MSG组外，变形杆菌门是丰度最高和最大的门；而在海水环境下，凡纳滨对虾肠道中Chloroflexi的丰度远远低于其他组。有趣的是，无论在淡水还是海洋养殖环境中，虾肠道中的放线菌门的数量都比沉积物中的多，这意味着虾肠道可能会从附近的环境中富集放线菌。同时，在不同的环境条件下，厚壁菌门、蓝藻门、拟杆菌门是虾肠道和沉积物中的其他优势菌。
变形杆菌门是革兰氏阴性菌的主要门类。现已查明，变形杆菌是活性污泥、废水处理反应器和沉积物中最丰富的一种微生物，在废水处理反应器的碳复合物降解和脱氮过程中起着关键作用。作为鱼塘中最丰富的一种微生物，变形杆菌参与了水生生态系统中的各种生物地球化学过程（例如碳、氮和硫循环）。以往研究表明，变形杆菌是人类肠道微生物群中最丰富的一种，也是人类疾病的常见因素。一些研究人员已经证实，变形杆菌是虾的主要肠道微生物群。然而，变形杆菌门在虾肠微生物群中的作用还没有得到广泛的研究。
Chloroflexi是一种好氧兼性细菌，可在厌氧条件下进行光合作用，在海洋、潮间带、淡水表面和地下沉积物中含量丰富。我们的研究结果也表明，底泥中Chloroflexi含量较高，但淡水养殖底泥中Chloroflexi丰度几乎是海水养殖底泥的两倍，海水养殖环境下凡纳滨对虾肠道Chloroflexi含量的比值仅为2.36%。
放线菌门是一个分布在陆地或水生环境中的革兰氏阳性细菌门。据报道，放线菌被认为是厌氧消化污泥中的主要葡萄糖降解剂。此外，放线菌是著名的生物活性天然产品生产者，可用于分离潜在的益生菌。此外，放线菌是维持肠道内环境稳定的关键。据推测，与沉积物数据相比，凡纳滨对虾肠道内的革兰氏阳性（放线菌）和革兰氏阴性（变形杆菌）细菌保持平衡，以维持有机体内平衡。因此，研究虾肠道微生物群及沉积物等周围环境的特征，有助于对健康养殖提供指导。
另外两个优势门是厚壁菌门和拟杆菌门。一般来说，人体肠道微生物群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例存在显著相关性。肥胖受试者的微生物群显示出厚壁菌门/拟杆菌门比率增加。相反，厚壁菌门/拟杆菌门比率下降与体重减轻直接相关。据报道，厚壁菌门增加的成员可以增加脂质滴的数量，从而相应地增加脂肪酸吸收比例。此外，在不同的生命阶段，厚壁菌门与拟杆菌的比例也在演变。结果表明，淡水养殖环境中对虾的厚壁菌门/拟杆菌门比例为15.35/0.8，而海水养殖环境中对虾的厚壁菌门/拟杆菌比例为3.06/3.31，这可能意味着淡水养殖对虾在某些养殖或环境因素下比海水养殖对虾胖。
在属水平上，共观察到789个属，其中12个优势属在4类样品中表现出显著差异。但我们对乳酸杆菌、链球菌和弧菌感兴趣，它们在这四组之间比较没有表现出统计学上的显著差异，但两组之间比较表现出统计学上的显著差异。在这项研究中，我们发现乳杆菌在淡水养殖虾的肠道中有富集的趋势，并且与其他三组相比，其比例非常高。乳酸杆菌是一个革兰氏阳性菌属，发酵己糖，主要生产乳酸。一般来说，乳酸菌的富集有益于胃肠道。此外，据报道，聚球藻菌属在海洋区域内很丰富，这就是为什么在本研究中我们发现，海洋养殖虾肠和沉积物中的聚球藻菌属非常丰富。弧菌是另一个仅在海洋养殖虾的肠道和沉积物中发现的属，尤其是肠道。以往的研究报告称，过量的弧菌可能改变虾的健康状况并导致疾病。因此，我们可以推测淡水养殖虾体内含有丰富的乳酸杆菌，可以维持虾肠道的健康状态，与海水养殖虾相比，可以避免弧菌的危害。
基于微生物在水产养殖中的重要作用，建立微生物生态战略对于维持虾养殖的成功和充分了解水生生态系统中的微生物区系特征具有重要意义。在不同的培养环境下，对一个生态系统中虾肠道和沉积物微生物群组成差异的研究很少。尽管最近的研究报告称，凡纳滨对虾肠道微生物群与沉积物中的细菌群落关系非常密切。我们的研究结果表明，在不同的培养环境下，凡纳滨对虾肠道和沉积物中的优势微生物类群是相似的，同时一些微生物类群，如放线菌、蓝藻门和Saccharibacteria，在肠道中丰度比在沉积物中丰度更高，但有些类群可能难以在凡纳滨对虾肠道中定植，如Chloroflexi、拟杆菌。以上结果对利用微生物群落特征指导凡纳滨对虾养殖具有一定的指导意义。
综上所述，本研究建立了不同养殖环境下虾肠道与沉积物的微生物群关系。本研究表明，虽然虾肠和沉积物的微生物群特征不同，但肠道微生物群落与沉积物之间的关系十分密切。此外，本研究还表明，虾的生理和生态与虾肠和沉积物中细菌的变化密切相关。这些研究结果可为了解虾与环境微生物区系的特征提供有价值的信息，并为两种育种方法下的微生态调控提供了大量的数据，以维持虾的成功养殖，充分了解虾与环境微生物区系的关系。
评论
环境微生物群在水生动物肠道微生物群中起着重要作用。凡纳滨对虾具有很高的商业价值和广盐性，已成为世界上最重要的虾商业品种。目前，往往采用高密度养殖方式以维持虾的高产。养殖后期有机质的大量积累往往导致水质不可控（亚硝酸盐、氨水等），进而导致潜在病原体的富集，益生菌种类减少，对环境微生物群的稳定性产生负面影响，从而对养殖虾造成环境压力。同时，环境中增加的大量病原体可通过消化系统进入虾的肠道，然后显著破坏虾的肠道微生物群。另一方面，属于底栖生物的凡纳滨对虾主要生活在中、下层水域，其水质受残留诱饵、粪便、死藻的积累和絮凝剂滥用的影响。该水层成为原生动物、细菌、病毒的滋生地和名副其实的“有毒层”，生物和化学耗氧量、氨氮、亚硝酸盐等有毒物质严重超标。如果不及时清除毒性层，会加重虾肝胰腺的负担，腐蚀肠粘膜，最终导致死亡。此外，凡纳滨对虾是一种广盐物种，广盐虾能适应广泛的环境盐度。虾肠道中的微生物群如何对环境盐度变化作出反应，不仅是水产养殖生理学研究人员的一个重要问题，也是鱼类产业的一个重要问题。有研究表明，盐度可以影响广盐水生动物的肠道细菌，但盐度变化与沉积物协同作用对肠道微生物群的影响仍然未知。该研究采用高通量测序法对淡水和海洋养殖环境中的肠道和沉积物微生物群落进行了研究。该研究揭示了（i）淡水和海洋养殖环境中肠道和沉积物之间微生物群的结构；（ii）沉积物对肠道微生物群结构的影响；以及（iii）肠道和沉积物之间微生物群组成的关系。该研究对利用微生物群落特征指导凡纳滨对虾养殖具有一定的指导意义。
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