科研 | Nat. Commun. ：慢性阻塞性肺疾病患者肠道菌群及其代谢组变化研究
编译：晨晓曦，编辑：Tracy、江舜尧。
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慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球第三大致死原因，表现为一种进行性炎症性肺病，目前尚无有效治疗方法，有研究表明肺部微生物群参与了COPD的进展，但肠道微生物群的功能尚不清楚。在这篇文献中，作者通过检测COPD患者与健康对照者的粪便微生物组和代谢组，发现两组之间有146种细菌种类不同，其中包括链球菌、前庭链球菌和紫杉科的多个成员；也通过非靶向代谢组学鉴定了COPD特征，包括46%的脂质、20%的外源性和20%的氨基酸相关代谢物。此外，作者还通过疾病相关网络将副桑圭链球菌与慢性阻塞性肺病相关代谢物（包括N-乙酰谷氨酸盐及其类似物N-氨甲酰谷氨酸盐）进行关联，结果表明COPD患者的粪便微生物组和代谢组与健康人不同，该研究为后期寻找COPD的生物标志物提供研究基础。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 参与者特征分析
作者通过评估28位COPD患者和29位健康对照者的粪便形态、饮食习惯、吸烟状态、用药史、肺活量及血细胞计数的信息，发现与健康对照组相比，COPD患者的每日纤维摄入量较低，脉搏率、总白细胞、中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞计数则较高。
2. 基于16S rRNA基因测序的COPD患者粪便微生物组分类指标研究
为了比较COPD患者和健康个体之间的肠道细菌群落组成，作者最初进行了16S rRNA基因测序，在所有57个粪便样品中鉴定出4285个序列变体，在过滤了至少两个样品中存在的最小相对丰度为0.05％的序列变体后，保留了977个序列变体用于群落分析，然后发现，在COPD患者和健康个体的肠道菌群之间，总体群落组成存在显着差异，COPD患者丰富度的属包括链球菌和Rothia， COPD患者减少的属包括拟杆菌科的拟杆菌属，玫瑰蔷薇属和拟螺属及芸香球菌科的几个未命名属（图1）。
图2 基于基因组测序的COPD患者与健康个体粪便微生物组区别的研究
a多元稀疏偏最小二乘判别分析；b分离的基因组以及（a）的sPLS DA组分1，红色代表COPD样本，蓝色代表健康样本；c（a）中sPLS-DA组成部分1的差异基因组热图。
4. 微生物组的变化与疾病状态关系研究
前庭链球菌和两种未命名的链球菌（sp001556435，sp000187445）在慢性阻塞性肺病样本中显著富集，而RC9基因组在健康样本中富集。作者比较了COPD样本中药物相关亚组，发现服用吸入性类固醇、β受体激动剂或抗胆碱能药物的患者与未服用这些药物的患者的微生物组分无显著差异。相关分析显示链球菌sp000187445与前庭链球菌和强迫性链球菌呈负相关，spfo75与肺功能呈正相关（图3）。结果证实粪便微生物群和慢性阻塞性肺病状态存在联系，确定了与健康和疾病相关的物种；血液中性粒细胞、肺功能和急性发作频率表明，与疾病严重程度有一定的关联。
图3 粪便微生物群成员与肺功能的关系
热图框中的白色星星表示显著性结果（(*p< 0.05; **p< 0.01）
5. COPD患者粪便微生物群的潜在功能指标研究
作者在与现有数据库（Pfam、TIGRFAM、KEGG和CAZy）比对的基础上，用预测函数对宏基因组的读数进行注释，以便对未组装的异基因组进行以基因为中心的分析，发现在所有注释域的比较中，COPD和健康样本的总体预测功能容量无显著差异。随后的研究也发现在COPD患者中富集葡萄糖基转移酶：PF02324（Pfam）、TIGR04035（TIGRFAM）、K00689（KEGG）和GH70（CAZy），LPXTG锚定的粘附结构域（K12472和TIGR04225）是革兰氏阳性菌中发现的一种细胞表面锚定基序，在COPD患者样本中也有富集，葡萄糖基转移酶与唾液链球菌和链球菌sp001556435 gtfC基因一致，在丰富的参考基因组中有多个拷贝。此外，
为了比较基因组内的编码功能的差异，作者进行了有针对性的基因组中心分析，结果显示COPD患者样本与健康样本之间编码功能存在显著差异（相对于健康对照组，35个富集于COPD，25个在COPD中缺失）。大多数预测的鉴别功能编码在富含COPD患者的基因组中，如副分泌蛋白Asp1-3；在COPD患者相关基因组中，多种氨基酸生物合成途径的元素也较丰富，脂肪酸生物合成起始酶和延伸酶也较丰富。而基因组与来自健康样本的CAG-138、CAG-239、CAG1000、CAG-302和CAG-508的相关，它们可能代表依赖宿主代谢物的肠道共生体，对环境扰动更加敏感。
6. COPD患者肺病粪便代谢组的功能指标研究
为了评估COPD肠道的代谢表达，作者对粪便样本进行了代谢组学分析，确定了934种可能来自微生物组和宿主的化合物，主成分分析结果显示，服用类固醇、β受体激动剂或抗胆碱能药物的COPD患者代谢组与不服用类固醇、β激动剂或抗胆碱能药物的患者代谢组无显著差异。
7. 基因组学和代谢组学的整合研究
作者使用mixOmics平台研究COPD患者和健康样本的代谢物，并将宏基因组和代谢组数据进行整合（图4），结果证实了副鳗鲡和唾液链球菌的富集与慢性阻塞性肺病有关（图4a，B）。在代谢组中，COPD患者样本在很大程度上是由代谢物的耗竭所决定的，在健康样本中，76%的已识别特征是高丰度的代谢物（图4c、d）。在我们从COPD患者分离出的前50种指示代谢物中，46%来自脂类、20%来自氨基酸以及20%来自外源类物质，这表明在COPD患者中脂质代谢可能发生改变。作者使用线性模型对协变量（年龄、性别和BMI）进行调整后，这些化合物中的16种都来自脂质、氨基酸或外源类，在COPD患者和健康样本之间具有显著差异。
图4 COPD患者与健康个体的粪便代谢组学分析
a基于微生物组数据的COPD和健康样本之间的区别;b分离的基因组以及（a）的组分1; c 基于代谢组学数据显示组间差异的DIABLO样本图;d分离的代谢物以及（c）的组分1。
8. COPD患者粪便代谢组学中脂质研究
在脂类中二羧酸盐、癸二酸、十一烯酸和十二烷二酸与大多数富含COPD的物种呈负相关（图5），它们可能来源于饮食或通过脂肪酸的ω-氧化内源性产生。由于他汀类药物的使用会影响脂肪酸氧化速率，作者将他汀类药物的使用进行调整，调整后COPD样本中的二羧酸不再显著减少，表明他汀类药物可能是导致这种表型的原因。
9. 氨基酸在COPD患者粪便代谢组中的作用研究
在无药物调整的情况下，两种氨基酸代谢物在COPD患者中被富集，三种被耗尽：第一种富集的代谢物N-乙酰尸胺在COPD组与健康对照组中无显著差异；第二种富集的氨基酸代谢物N-乙酰牛磺酸可由牛磺酸内源性产生，COPD患者和健康个体之间显著差异，在大多数与COPD患者和健康样本相关的基因组中，N-乙酰牛磺酸ABC转运蛋白的同源物厌氧杆菌sp002159845和Lachnospiraceae GCA900066575 sp002160825为N-乙酰牛磺酸转化为牛磺酸所需氨基水解酶的编码同源物，两种氨基水解酶编码的物种与N-乙酰牛磺酸的丰度呈正相关，但它们不是唯一显示这种趋势的物种（图5）。在未经药物调整的COPD患者的三种消耗性氨基酸代谢物为N-乙酰谷氨酸盐、N-乙酰脯氨酸和6-恶哌啶-2-羧酸盐，前两种在扩展线性模型中显著减少，在慢性阻塞性肺病中富集的大多数基因组编码N-乙酰谷氨酸合酶，它是谷氨酸生成N-乙酰谷氨酸所必需的，但在健康样本中富集的基因组中则有五个。结果表明健康样本中代谢物丰度的增加可能是内源性代谢或饮食摄入改变的产物，而另外两种富含在健康样本中的氨基酸代谢物的作用尚不清楚。
图5 COPD和健康个体的相关代谢物
白色星星表示显著相关性（*p<0.05；**p<0.01，t检验）
10. COPD患者粪便外源性代谢产物研究
慢性阻塞性肺病中增加的外源类代谢物包括烟草代谢物可替宁、呼吸道药物沙丁胺醇、N-氨甲酰谷氨酸盐和哈曼，它们都对肠道有潜在的有益作用。N-氨甲酰谷氨酸盐是乙酰谷氨酸的类似物，在补充后对动物肠道有有益作用，比如刺激精氨酸合成、防止氧化应激和上皮细胞增殖，然而，它在人体肠道内的来源是未知的，β-卡波林生物碱-哈曼存在于植物中，也是一种细菌代谢物，在肠道中可能有多种来源。
11. COPD的疾病相关网络
作者使用10个以上样本中确定的物种和代谢物进行了基于代谢组学和元基因组数据集整合的网络分析（图4），定义了三个不同的微生物组/代谢物簇（图6）。第一网络研究表明副桑寄生杆菌（S.parasanguinis_B）、钌杆菌（rutheribacterium sp.）和厌氧杆菌sp002159845以及13种代谢物（图6a）之间的关联；第二和第三网络不包含任何富含COPD或健康样本的节点，这可能表示疾病状态之外的交互作用（图6b，c）。
图6 基于粪便微生物组和代谢组的慢性阻塞性肺病相关网络
节点之间的正相关用红色连接线表示，负相关用蓝色表示。COPD或健康样本中富集的物种和代谢物分别用实线或虚线表示。
12. 链球菌科家族成员在共生肠道菌群中的富集研究
为验证微生物组学结果，作者对38个样本（16个COPD患者和22个健康个体）进行了宏基因组测序，结果显示COPD和健康粪便样本可根据细菌群落特征进行区分。在COPD或健康样本中富集的210个基因组中，59个在验证队列中显示出类似的富集趋势，其中33个达到显著水平，包括6个在COPD样本中富集的链球菌，以及在健康样本中富集的RC9、CAG-302和UBA1524 sp000437595。在研究队列中被确定为COPD和健康样本的关键差异因子的30个基因组中，有11个位于验证队列中的前30个基因组中（图7a，b）；在功能水平上，COPD样本中显著富集的8个域中有6个在验证队列中遵循了类似的趋势。这表明，科研人员可能还需要更大的队列来明确区分基于肠道的慢性阻塞性肺病样本元基因组功能能力，这些数据证实了肠道微生物群的特定成员与COPD之间的联系，为它们在疾病模型中的测试提供了基础。
图7 肠道菌群与COPD在独立队列中的关联
a多元稀疏偏最小二乘判别粪便微生物组基因组水平上基于读取映射的相对丰度分析；b与（a）中sPLS-DA的成分1分离有关的基因组。
#表示与临床表型相关的基因组；^表示疾病相关网络中的基因组
讨论
作者通过对COPD患者的肠道微生物群和代谢组分析，发现稳定期COPD患者的粪便微生物组和代谢组均与健康对照组具有显著差异。COPD吸烟者与不吸烟者之间的微生物组分无差异表明微生物组分的变化是一种与疾病相关的表型，而不是由香烟烟雾对肠道微生物组的影响所驱动的表型。由于易位基因组的变化与疾病特征相关，所涉及的过程可能是治疗靶点或作为粪便生物标志物的输出物，但这还需进一步的临床和实验验证。作者发现几种链球菌的丰度增加，其中包括唾液链球菌，链球菌的富集与葡萄糖基转移酶和LPXTG锚定的粘附域的增加有关，这表明粘附能力是增加丰度的关键。据观察，肠道中链球菌的丰度增加与吸烟有关，而肺部和肠道中都存在这些微生物的一个可能原因是口腔微生物群的转移，链球菌菌株在健康成年人中表现出频繁的经口-粪便传播，在伴有咽部分泌物的呼吸道微呼吸被夸大的慢性阻塞性肺病中，传播率可能会增加。除了吸烟者不均匀地发展为慢性阻塞性肺病外，不同粘膜生态位的链球菌增多也支持了与这一现象相关的潜在遗传倾向，例如粘膜免疫改变或抗体分泌，虽然链球菌与COPD状态相关，但链球菌物种丰度和肺功能之间的相关性有限，而与其他疾病指标没有相关性。漆螺科的多个成员与肺功能降低有关，漆螺科成员也与和健康、疾病相关的肠道微生物群有关，多丽科的一个亚群也与炎症细胞因子的释放有关。属内表型效应的对比突出了物种间的变异性，这使微生物组数据的解释复杂化，也难以对非特征物种（如本文所述）的推断。COPD患者体内减少的两种代谢物是尿素循环中的第一种酶氨甲酰磷酸酯合成酶Ⅰ的辅因子、天然辅因子N-乙酰谷氨酸及其结构类似物N-氨甲酰谷氨酸。作者观察到慢性阻塞性肺病患者的二元酸水平降低，这可能是由于队列中他汀类药物使用的增加，这些代谢物通过脂肪酸的欧米茄氧化内源性生成，并通过尿液排出。血清分析结果显示，亚油酸（C8）、癸二酸（C10）与壬二酸（C9）含量与FEV呈正相关，但与COPD78的诊断无显著相关性，他汀类药物的使用在该研究中没有报道。与健康吸烟者相比，COPD患者的分离外周血单个核细胞脂肪酸氧化减少，表明脂肪酸代谢受损，而脂代谢的改变可能仍然与COPD有关；除了药物的影响，这可能需要更大的队列来进行梳理。同时，作者观察到COPD患者的膳食纤维摄入量低于对照组，这可能是肠道微生物组学特征和COPD病理学差异的原因之一；而膳食纤维在小肠内抵抗消化，到达结肠后，可溶物部分被共生菌发酵，一些可溶性纤维充当益生元，提供选择性生长基质，导致细菌数量和多样性的变化，并增加免疫抑制副产物的产生，这在动物和人类哮喘模型中已被证明可以减少气道炎症，因此，增加慢性阻塞性肺病的纤维摄入量是一种具有可能性的相关治疗策略。在本篇文章中，作者试图用所讨论物种的编码遗传潜力来确认观察到的微生物-代谢物的关联，重点关注在慢性阻塞性肺病和健康样本之间被确定为不同的物种和化合物，作者观察到遗传潜力的重叠，但未发现数据集之间的明确联系，虽然这可能是由于外部因素的作用，特别是药物作用，但也有可能是负责代谢物特征的物种在群体间并不丰富，而由疾病特异性环境变量触发的差异性活动水平，以及未被推断的代谢潜能所捕获的差异性活动水平，可能会诱发这种信号。为了评估这一点，还需要科研人员对微生物组进行互补性的meta转录组学或蛋白质组学分析，并可能改进微生物和代谢组数据集的整合。在个体和混杂因素之间，肠道微生物组学特征的公认差异可能限制了检测COPD的其他重要分类和功能性生物标志物的能力，文章的研究也局限于稳态疾病，未捕捉到疾病恶化期间的肠道环境。尽管有这些局限性，但宏基因组和代谢组学数据都显示肠道是COPD疾病生物标志物的潜在来源。研究人员应使用已建立的动物模型进一步评估这些微生物与代谢物在慢性阻塞性肺病中的因果关系。