科研 | PNAS：致病性亨廷顿蛋白特异性位点泛素化可减轻其损害作用
编译：雨辰，编辑：Emma、江舜尧。
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亨廷顿氏病是一种进行性不可治愈的神经退行疾病，具有运动和神经疾病的特征。它是一种常染色体显性疾病，亨廷顿蛋白突变会在大脑中聚集并诱发亨廷顿氏病。已有研究表明，亨廷顿蛋白与泛素-蛋白酶体系统的组成有关，与蛋白酶体的功能相关，但其在亨廷顿患者脑中未被降解，原因尚不清楚。在本文中研究者使用了一种新的亨廷顿大鼠疾病模型,并利用蛋白质组和长期活神经元成像技术来检测泛素化对亨廷顿蛋白突变体聚集和后续细胞反应的影响。研究人员发现，在大鼠的纹状体和皮质脑组织中，亨廷顿突变蛋白第一个外显子中第6和9赖氨酸位点可以被特异性地泛素化。在皮质神经元和培养细胞中，缺乏这些泛素化位点的亨廷顿突变蛋白，其聚集程度和速率都显著降低，同时出现更多小的和不可见的聚合物。重要的是，缺乏泛素化位点的亨廷顿突变蛋白高表达与高死亡率有关。蛋白质组学分析表明，蛋白赖氨酸缺失的细胞对亨廷顿蛋白突变的反应较弱，意味着其应对蛋白毒性应激的能力下降。综上所述，该研究发现了泛素化的新功能-对亨廷顿突变蛋白致病效应的衰减作用。
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实验设计
1.使用新的亨廷顿疾病模型-BACHD大鼠，并提取BACHD大鼠的纹状体和皮层。利用泛素化抗体富集和液相色谱质谱，分别对野生型大鼠和BACHD大鼠脑波纹体和皮层内泛素化蛋白进行检测。
2.构建EGFP融合质粒，将大鼠皮质神经元细胞内亨廷顿蛋白第6位和第9位赖氨酸突变为精氨酸，观察亨廷顿蛋白的在细胞内的聚集情况并研究亨廷顿蛋白聚合物的溶解特性。
3.在HK293细胞中重复皮质神经元内亨廷顿蛋白赖氨酸突变试验，并检测其对于细胞的损伤作用及致死性。
4.利用蛋白组技术对亨廷顿蛋白赖氨酸突变后的HK293细胞进行蛋白组变化检测，分别探究10%SDS溶解条件下和NP-40溶解条件下，蛋白质组分的变化情况，并对差异蛋白进行生物信息学分析。
实验结果
1. 亨廷顿疾病大鼠中亨廷顿蛋白突变体第6和9位赖氨酸特异性泛素化
亨廷顿疾病的动物模型对于阐明该疾病的重要途径非常重要，该研究利用了一个新的亨廷顿疾病模型-BACHD大鼠，此模型克服现有小鼠模型的许多缺点。BACHD大鼠表达具有97个谷氨酰胺残基的人全长亨廷顿蛋白，这些大鼠表现出早期亨廷顿疾病缺陷。为了检测大鼠中亨廷顿突变蛋白的泛素化分布，对15个月龄BACHD大鼠的大脑切片（纹状体和皮层）进行了蛋白质组学分析，并与相应野生型大鼠进行了比较（图1A）。经过泛素化抗体富集和质谱检测，研究人员发现，在皮质和纹状体组织中亨廷顿突变蛋白（mutanthuntingtin ，mHtt）的N末端结构域第6和第9位赖氨酸均高度泛素化，与野生型亨廷顿蛋白同源的两个赖氨酸残基形成鲜明对比（图1B）。重要的是，在BACHD和野生型大鼠中，亨廷顿蛋白的N末端结构域的第15位赖氨酸残基都没有被泛素化修饰(图1C)。
图1 在亨廷顿疾病中亨廷顿突变蛋白外显子1高度特异性泛素化
A.蛋白组检测野生型和BACHD大鼠中泛素化修饰的流程。B.野生型和BACHD大鼠脑标本中差异表达泛素化肽段的火山图。C.不同样本中第6和9位赖氨酸上泛素化的亨廷顿蛋白N端肽段的强度以及总亨廷顿蛋白的测量值。
2. 亨廷顿突变蛋白的泛素化导致形成更多更大的可见聚集体
为了检测亨廷顿突变蛋白特异性泛素化对聚集体形成的潜在作用，研究人员将两个赖氨酸残基替换为不能泛素化的精氨酸残基，构建了编码亨廷顿突变基因外显子1的两个质粒，其中含有134个谷氨酰胺残基(图2A)。两个质粒分别为未突变赖氨酸(Htt134Q)表达蛋白质粒，和将赖氨酸6和9突变为精氨酸(Htt134Qm)表达蛋白质粒。为了便于观察聚集情况，在质粒末端同时插入含有荧光蛋白EGFP的片段。研究人员在原代培养的大鼠皮层神经元中，使用了长期成像技术跟踪这两种质粒表达蛋白的变化。结果显示，与Htt134Qm细胞相比，表达含有两个赖氨酸残基蛋白的细胞(Htt134Q)中可见聚集物的数量和大小明显更大(图2B-E)。赖氨酸突变对于单个团聚体形成速率影响较小(图2F)，在没有赖氨酸6和9的情况下(大的)聚合成核速率较慢。
图2 Htt134Q:EGFP N端结构域的位点特异性泛素化影响聚集物的数量和大小，但不影响其生长动力学
A.质粒FU-Htt134Q:EGFP的结构示意图。B.慢病毒转染后皮质神经元的延时图像FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm。C.转染引起的聚集体总数量随时间的变化(单个实验中每个条件的一个感兴趣的区域)。D.三种不同的实验，转染后聚集体的总数量随时间的变化。在每个实验中，聚合数被均一化为Htt134Q:EGFP在第11和12天的平均聚合计数。E.聚合荧光信号转染后随时间的变化。取三个独立实验的平均值。(F)单个团聚体的形成率。个体聚集被追溯到它们出现的那一刻。然后获得每个聚集体随时间变化的荧光值，并根据在聚集体出现之前测量的背景荧光值进行校正。
3. 泛素化的亨廷顿蛋白聚集物比其赖氨酸突变聚集物更少且更易溶解
为了研究泛素化对聚集物特性的影响，研究人员分别采用温和裂解条件（NP-40）和更烈性的溶解条件(10%十二烷基硫酸钠[SDS])溶解表达Htt134Q:EGFP、Htt134Qm:EGFP和Htt17:EGFP(具有17个谷氨酰胺重复的外显子1)的HEK293细胞。从NP-40可溶性实验可以看出，Htt134Q:EGFP比赖氨酸突变细胞在NP-40中溶解性更强（图3A），蛋白质组学可溶性分析显示，大量来源于Htt17Q:EGFP的肽完全溶解,来自Htt134Q:EGFP蛋白质或肽段少数溶解,以及来自Htt134Qm:EGFP的蛋白质多肽和肽极少溶解(图3B)。10%SDS可溶性的点免疫分析显示，大多数Htt134Qm:EGFP可溶(图3C)。虽然在数量和大小上可见Htt134Qm:EGFP聚合物总量均明显小于由Htt134Q: EGFP产生的聚合物(图2C-E)，但从点免疫强度可以明显看出，在Htt134Qm:EGFP表达细胞中病理蛋白的数量始终较高。
解释这一现象的最合理原因是：Htt134Qm: EGFP总量远远大于那些Htt134Q:EGFP,但Htt134Qm大多数是看不见的，荧光显微镜检查时由于方法的分辨率和灵敏度有限无法直接检测出来(图2C和D)。作者同样发现，K6位点泛素化只在Htt134Q:EGFP变体中被发现，并且只出现在在其不可溶部分中(图3D)。因此，泛素化似乎是唯一的不溶性聚集物，很可能是泛素化影响聚集形式，进而决定聚集物的大小和数量。
图3 对不同突变细胞内聚集物特性的探究
(A)使用抗htt(i)或抗EGFP (ii)抗体对NP-40可溶性部分中的mHtt变体(17Q:EGFP,134Q:EGFP，和134Qm:EGFP)进行Westernblot分析。(B) NP-40可溶性组分的质谱分析:(i)基于质谱的对mHtt肽定量;(ii)基于质谱对所有EGFP多肽的定量。(C)NP-40不溶性和10% SDS可溶性馏分分析。(i)对三个独立实验的不溶性部分进行Dotblot分析；(ii) Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP的平均强度。(D)基于质谱对NP-40可溶性和不可溶性中Htt-k6泛素化肽的定量(10%SDS可溶)。
4. Htt位点特异性泛素化可降低细胞死亡
为了研究赖氨酸6和9残基泛素化的潜在病理生理效应，作者首先在HEK293细胞中重复在培养的神经元中的结果。为此，使用了高含量成像系统分析大量表达Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP(以及HttQ17: EGFP)的HEK293细胞。如图4A所示，使用Htt134Qm:EGFP转染后的HEK293细胞中可见聚集物数量低于Htt134Q:EGFP产生的聚集物数量，基本再现了原代神经元中观察到的现象(图2C和D)。细胞计数(图4B)和活/死标记(图4C)结果显示，与表达Htt134Q:EGFP的细胞相比，Htt134Qm:EGFP的表达导致活细胞数量的显著减少及更高水平的细胞死亡。同时，在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中表达Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP时也观察到类似的现象（图4C）。
图4 Htt134Q:EGFP泛素化缓解mHtt的蛋白毒性作用
A.HEK293细胞过表达FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FUHtt134Qm:EGFP-Wm用DNA结合染料NucBlue染色.(B)用FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm转染HEK293细胞。(C)用FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm转染HEK293和SH-SY5Y细胞。死亡细胞的百分比以PI阳性细胞相对于NucBlue阳性细胞的数量计算。(i)HEK293细胞的代表性图像PI阳性(红色)和NucBlue阳性（蓝色）。(ii和iii)HEK293 (ii)和SH-SY5Y(iii)细胞的死亡细胞百分比。
5. 细胞内蛋白组变化与N末端泛素化位点消除有关
在Htt134Q:EGFP中，用精氨酸取代6和9位赖氨酸，使聚集体延迟出现、产生更多更小的可溶性聚集物、及导致更高的细胞死亡。为了阐明这些突变损害细胞活力的潜在机制，研究人员对表达Htt134Q:EGFP、Htt134Qm:EGFP或Htt17Q:EGFP的HEK293细胞进行了蛋白质组学分析。主要包括两个类型的试验：1.用10%的SDS溶解细胞，经SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并对凝胶中积累的物质进行质谱分析。2.在较温和的条件下提取细胞内容物(NP-40)，再用10%的SDS溶解，然后对每个部分进行蛋白质组分析。结果显示，对不溶性部分的蛋白质组学分析反应Htt134Q:EGFP/Htt134Qm:EGFP和Htt17Q:EGFP之间、Htt134Q:EGFP和Htt134Qm之间的巨大差异。然而，并未发现表达不同蛋白质的细胞之间及两种实验之间有显著差异。因此，许多蛋白质与mHtt聚集物相关联，但这种关联是相对非特异性的，不依赖于N端位点泛素化与否。
研究人员进一步分析发现，在表达Htt134Q:EGFP的细胞中有相当数量的蛋白质比那些表达Htt134Qm:EGFP的细胞更丰富，对这些蛋白的功能分析指出了多种生物过程存在显著变化（图5B）。受到影响最深的途径包括RNA代谢、细胞内转运、线粒体相关代谢和基因调控等。与之相反，对表达Htt134Qm的细胞中丰度增加的蛋白质进行类似的分析表明，这些通路的变化更小。以上分析表明，在赖氨酸位点被突变的细胞中，细胞对mHtt表达的反应较弱，这可能意味着应对蛋白毒性应激所需的诱导机制减少。
此外，为了进一步鉴定特异性蛋白以及探究蛋白在不同细胞内丰度变化，研究人员采取了更为严格限制条件：1.至少在四次实验中重复鉴定到；2.最小变异系数位1.75；3.Htt134Qm:EGFP 组内p值小于0.05.经过筛选共鉴定到12个差异表达的蛋白。这些差异蛋白一定程度上解释了，表达mHtt外显子1缺乏泛素化位点细胞存活率较低的原因。
图5 Htt134Q:EGFP泛素化对细胞蛋白质组的影响
(A)相对于Htt134Qm:EGFP的细胞，在表达Htt134Q:EGFP细胞中上调的蛋白数，反之亦然。(B)使用STRING数据库对A中显示的差异表达蛋白进行生物过程富集，(i)从分析凝胶溶解蛋白得到的数据;(ii)NP-40溶解蛋白的数据。
讨论
神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森氏症和亨廷顿氏舞蹈病)的特征是在大脑不同区域产生聚合蛋白。这些大的聚集物来源于较小的、不可见的、可溶的低聚物/聚集物，并被认为与基本的细胞机制不同，所以导致疾病的发生。与之形成对比的是，许多途径通过降解/捕获小分子，进而抑制聚合物的形成。通常以降解蛋白为靶标的泛素化，在这一过程中发挥的作用尚不清楚。研究人员证实，泛素化的致病Htt是重要的，它可以降低有害性。抑制其泛素化导致产生大量的小的和不可见的聚集物，这些小的不可见的聚集物对细胞更加有害。这一发现阐明了泛素化在塑造mHtt聚集物的大小、数量、可能的形态方面的新作用，以及它可能通过何种方式减弱mHtt的致病性，该结论对于防治亨廷顿氏舞蹈病具有潜在作用。
结论
在本文中，研究人员使用一种新的HD模型(细菌人工染色体HD[BACHD]大鼠)，对表达不同mHtts的神经元进行长期成像，生化分析，以及蛋白质组学分析，以探究mHtt泛素化对其聚集和随后的细胞反应的影响。结果显示，mHtt第一个外显子中的两个赖氨酸残基6和9位在BACHD大鼠的纹状体和皮质脑区域特异性泛素化，而野生型(WT)大鼠则未出现。含有134个谷氨酰胺重复体的mHtt(含有EGFP标签)外显子1的细胞表达试验证实，当这些泛素化位点发生改变时，可见聚集物的数量和大小显著减少。然而，生化分析显示赖氨酸突变后聚集物的可溶性更低，其数量明显高于泛素化蛋白，而且其中许多聚集物体积很小，在光学上不可见，但在生物化学上可检测到。重要的是，这些小的聚集物对细胞的伤害比它们的非突变同类更大，会导致更多的细胞死亡。与这些发现相关联的是，蛋白质组学分析表明泛素化的mHtt可以更有效地诱导多种细胞反应，这可能是为了应对mHtt表达所带来的细胞应激。相反，缺乏这些泛素化位点的mHtt变体只能诱发较弱的反应。