编译：Jonie、song，编辑：十九、江舜尧。
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导读
甲藻是海洋藻化（HAB）的主要来源。在过去的几十年，由于人为活动和全球环境变化，甲藻诱导藻化的地理分布、频率和规模迅速扩大，对海洋生态系统、海水养殖以及人类健康造成了严重影响。相关研究表明，甲藻对环境的适应能力决定了其繁殖能力，许多浮游植物进化出多种适应P缺乏环境的调节机制，在生存环境缺乏P时可利用其在囊泡中储存的P。但是相关研究在甲藻对环境P的变化中，对其适应性和反应机制了解甚少。因此，为了解东海原甲藻对环境P变化的适应途径以及溶解有机磷（DOP）和溶解无机磷（DIP）再补充的反应机制，研究人员对P充足，P缺乏以及DIP再补给和DOP再补给条件下东海原甲藻的转录组进行比较分析，并且对差异表达基因进行了表征。结果表明编码低亲和力和高亲和力的P转运蛋白基因在P缺乏的细胞中显著下调，而有机磷利用的基因显著上调，表明东海原甲藻具有强大的利用P的能力。膜磷脂分解代谢的上调和内吞作用为P缺乏细胞提供了细胞内和外的有机磷，而且东海原甲藻对溶解无机磷（DIP）或溶解有机磷（DOP）再补给的生理反应表现出不显著的差异。转录组学结果显示DIP再补给后的多个基因的表达显著改变，但是很少伴随着生物学过程的变化。但在DOP再补给的细胞中，与细胞生长相关的诸如翻译，转运，核苷酸、碳水化合物和脂质的代谢显著改变。本研究表明东海原甲藻进化出多样化的DOP利用途径以适应低磷环境，并且DOP可能在东海原甲藻的生殖形成中发挥关键作用。原名：Transcriptomic response to changing ambient phosphorus in the marine dinoflagellate Prorocentrum donghaiense
译名：东海原甲藻对环境磷变化的转录组应答
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间：2019年7月
通讯作者：王大志
通讯作者单位：厦门大学环境与生态学院
技术路线图
所有处理的东海原甲藻细胞在前2天生长缓慢。从第3天到第5天，P细胞迅速增殖，细胞密度从4.0×104个细胞/mL增加到1.2×105个细胞/mL，然后在第6天到第10天进入静止期（图.1A）。对于缺乏P的培养物，从第3天到第10天，细胞增殖停止，平均细胞密度为4.0×104个细胞/mL。然而，在第6天再次补充磷酸氢二钠或G-6-P后，细胞生长立即恢复，并且在第10天，两组的细胞密度均超过1.5×105细胞/mL（图1A）。
由于溶液中的P在第1天被迅速吸收，因此在P充盈细胞和缺乏细胞中P含量增加（图1B和C）。从第2天到第5天，P细胞中的P浓度和P含量随着细胞密度的增加而降低，并且在第5天检测不到P。然而，从第1天到第5天，大量APA非常低，并且从第6天到第10天略有增长（图1D）。在P缺乏细胞中，P在第2天检测不到，P含量下降至低水平（图1B和C），并且大量APA从第3天开始增强（图1D）。在P再供应4小时后，在再供应磷酸氢二钠的细胞中P耗尽，并且再供应G-6-P的细胞中的P浓度从10.0μM迅速降低至2.5μM。P再供应4小时后P含量显着增加，然后下降（图1C）。在P再供应4小时后，大量APA也迅速下降，并且从第7天到第9天保持稳定。然而，在第10天，在DIP和DOP再供应的细胞中，大量APA再次升高（图1D）。
在P充盈细胞和缺乏细胞中，Fv / Fm从第0天增加到第3天（图1E）。在P充盈细胞中，Fv / Fm在第4天达到峰值（约0.6），然后在第10天逐渐降低至约0.2（图1E）。然而，它在P缺乏细胞中从第4天开始减少到实验结束。在第6天P再补充后，Fv / Fm从第7天增加到第8天，然后在第9天下降（图1E）。
图1 东海原甲藻对环境P改变的生理反应。
2 测序，重新组装和功能注释
使用Illumina HiSeq TM 2000对合格的cDNA文库进行测序（原文表1）。通过KEGG和GO数据库对注释的序列进行的进一步功能分析，结果显示，转录中涉及的序列比例很高（63.51％对RNA转运，60.14％对mRNA监测途径，原文图S1A），翻译和表达（67.7％的翻译，核糖体结构和生物发生，原文图S1B）。
3 P缺乏和DIP/DOP再补充的转录学分析
在236,500个序列中，27434（11.6％）个序列通过六种成对处理的比较表现出显着差异（表S3）。在P缺乏细胞中，与P 充盈细胞相比，1.8％的序列被上调，0.3％被下调（图2A）。P再补充后，DOP补给细胞中DEG的数量高于DIP补给细胞中的DEG数量，特别是对于具有上调表达的序列（图2A和B）。值得注意的是，在P供应4小时和28小时后，DIP和DOP再供应细胞之间仅分别有2.1％和5.3％的DEG（图2B）。
东海原甲藻对DIP和DOP补充显示出不同的反应，分别在DIP和DOP再供应细胞中鉴定出4和14个显着富集的代谢途径（表2）。DIP再利用4小时后，DOP利用率（酸性磷酸酶，磷脂酶D（PLD），蛋白磷酸酶）和剪接（剪接因子）相关的序列迅速下调，而在DOP再补给4小时后，编码脂肪酸合成的序列（乙酰辅酶A羧化酶）首次下调（表S4）。尽管与P缺乏细胞相比，在DIP和DOP再供应28小时后许多序列的表达没有恢复，但是在DIP和DOP再补给28小时后更多的序列包括ATP合成相关的序列被下调（表S4）。
在DIP再供应4小时后未鉴定出显着富集的代谢途径，而在DIP再供应28小时后，与转录，翻译，碳水化合物代谢和能量代谢相关的6个代谢途径显着富集（表2）。然而，在DOP再供应4小时和28小时后鉴定出4和12个显着富集的代谢途径，并且这些途径涉及碳水化合物代谢，核苷酸代谢，转录，翻译，脂质代谢和能量代谢（表2）。
图2 东海原甲藻中响应P耗尽和P再补给的DEG统计数据
表2：在DIP-与DOP-再补给之后具有显著变化的代谢过程
4 DEG的qRT-PCR验证
为了验证RNA测序的数据，选择10个差异表达基因进行RT-qPCR分析。无机磷酸盐转运蛋白（PiT）、高亲和力磷酸转运蛋白（PHT）、碱性磷酸酶（AP）、PLD、丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白1（SRRM1）、富含丝氨酸结构域1的RNA结合蛋白（RNPS1）、6-磷酸果糖激酶（PFK1）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、AP-2复合物亚基α（AP2A2）和发动蛋白GTP酶（Dyn GTP酶）的表达水平用参考基因钙调蛋白（calm）标准化。通过qRT-PCR测定的经P充盈，P缺乏，DIP和DOP再补给处理PiT，PHT，AP，PLD，SRRM1，AP2A2和Dyn GTP酶的表达模式与RNA测定的表达模式一致，而仅与RNPS1，PFK1和ACC相关的50个比较中有4个不一致（图3）。此外，大多数序列的表达显示两个数据集之间没有统计学上显着的差异（t检验p N 0.05）。这些结果表明，总体上，RNA测序方法为表达谱分析研究提供了有意义的参考。
图3. DEG的qRT-PCR验证。管家基因calm作为内参对照
1 东海原甲藻对环境P缺乏的反应机制
1.1 磷酸盐转运
与许多其他浮游植物物种相比，东海原甲藻的磷酸盐转运没有增强，但在缺磷条件下受到抑制。尽管细胞增殖对P再补充有快速反应，但在缺乏P的东海原甲藻中未观察到与P缺乏相关的转录信号。此外，磷缺乏型转运蛋白的表达水平在P缺乏的沟鞭藻的蛋白质组中变化不明显。磷酸盐是浮游植物的首选溶解磷源。在缺磷条件下，许多浮游植物物种在转录和蛋白质水平上通过上调磷酸转运蛋白的表达来增加磷酸盐吸收，例如绿藻莱茵衣藻、疟原虫无刺球绦虫、硅藻假海链藻，骨条藻属和中肋骨条藻。然而，在P缺乏条件下，硅藻三角褐指藻中与磷酸盐摄取相关的蛋白质的表达下调。在我们的研究中，在东海原甲藻中鉴定了28种磷酸转运蛋白的转录物，包括4种高亲和性磷酸转运蛋白，22种线粒体磷酸转运蛋白和47种钠依赖性无机磷酸盐转运蛋白（表S5），表明东海原甲藻具有高-亲和磷酸盐吸收系统。然而，只有2个PiT和4个PHT的表达在P缺乏细胞中显着下调（图4），并且P再补充后没有检测到显着变化（图5），尽管P被快速吸收（图4 1B和表S5）。因此，东海原甲藻可具有其他未知的磷酸盐转运机制以实现对环境P缺乏的适应。
1.2 磷酸盐稳态
细胞无机磷酸盐水平可以通过酵母抑制因子gpa1 /酵母磷酸酶81 /人类异嗜性和多变性逆转录病毒受体1（SPX）蛋白与由肌醇多磷酸盐触发的转录因子结构域的结合来感知。含SPX结构域的蛋白质在控制真核细胞磷酸盐稳态中起关键作用，包括无机磷酸盐摄取，转运，储存，膜脂重塑和信号系统。在本研究中，含有SPX结构域的膜蛋白的转录水平在P缺乏条件下上调2.5倍，并且在P补充后28小时没有观察到显着差异（表S5）。参与液泡多磷酸盐积累的编码含SPX结构域蛋白的单基因的表达在P缺乏细胞中下调8.8倍，并且在P补充后没有发生显着变化（表S5）。当环境P供应充足时，东海原甲藻可以类似于硅藻中肋骨条藻和假海链藻将磷酸盐作为细胞内多磷酸盐储存在液泡中。在P缺乏的东海原甲藻中抑制了多磷酸盐合成（图4），并且摄取到细胞中的过量P不用于多磷酸盐合成，而是用于P再补充后的细胞增殖（图5）。虽然多磷酸盐的关键作用相对清楚，但控制其变异性和代谢的机制却知之甚少。我们的结果表明在P缺乏的东海原甲藻细胞中细胞内P稳态被破坏，并且利用细胞内储存的P被利用。
1.3 有机磷利用
在DIP缺乏条件下，DOP可以作为浮游植物的主要替代P源。APA是DIP限制的指标，其随着限制的增加而增加，并随着限制的缓解而下降。在P缺乏时，APA显着升高，伴随AP转录物表达的显着上调（图4）。在P再补充后，在P再供应的28小时细胞中AP的活性和转录水平均显着下调（图5），而P再供应的4小时细胞的变化不显着（图1D，5和表S5）。东海原甲藻类似于短凯伦藻、中肋骨条藻和假海链藻可利用外源磷酸单酯（G-6-P）（图4）。然而，这些浮游植物物种对这两种磷形态的利用没有发现显着差异。G-6-P是一种容易被AP水解的低分子量的磷酸单酯。磷脂酶A1（PLA1）可以水解膜磷脂，并在细胞膜的维持和重塑中发挥重要作用。在P缺乏细胞中PLA1的转录水平显示增加5.9倍（图4），然而，在P补充后没有发现显着变化（图5和表S5）。磷酸二酯酶PLD的75个单基因的表达水平在P缺乏细胞中显着上调（图4），而在P再供应的28小时细胞中下调（图5和表S5）。PLD可以水解各种结构磷脂，产生磷脂酸和各种头部基团。此外，PLD在膜转运、细胞迁移、激素信号传导和环境应激反应中发挥不同的作用。PLD也可以被招募到细胞膜以响应环境和激素变化。此外，还鉴定了与磷脂代谢相关的基因，例如磷脂酶A1，UDP-糖焦磷酸化酶和乙酰胆碱酯酶，其在P缺乏细胞中表达水平升高（表S5）。磷脂转运ATP酶基因的表达水平在P缺乏时也显着上调，在P补充后下调（表S5）。据报道，磷脂转运ATP酶通过磷脂的水解产生磷酸盐。因此，在P缺乏条件下，东海原甲藻中细胞内磷脂的利用增强（图4），有机P成为主要的P源。
1.4 胞吞作用
胞吞作用在信号转导，质膜稳态，细胞外物质转运到细胞（如营养物，膜蛋白和脂质）和细胞对环境刺激的反应中发挥重要作用。在真核细胞中，网格蛋白介导的内吞作用是主要的转运机制，并且从网格蛋白包被膜的内陷开始，细胞外分子被包装到网格蛋白包被的囊泡中并被吸收到细胞中。AP2衔接子亚基α、Dyn GTP酶和PLD的转录物表达水平在P缺乏细胞中显着上调，并且在DIP或DOP再供应的28小时细胞中显着下调（图4，表S6和S7）。AP2在网格蛋白包被的凹陷成核的起始中起关键作用。据报道，Dyn GTP酶可调节网格蛋白包被的囊泡和内吞膜裂变的形成。PLD通过其phox同源结构域激活Dyn GTP酶并加速表皮生长因子受体的内吞作用。蛋白质转运蛋白SEC24作为外壳蛋白复合物II（COPII）的组分参与囊泡运输，其促进来自内质网的运输囊泡的出现。自噬体形成的第一步也需要SEC24，并且已知其磷酸化在营养缺乏期间调节自噬体的丰度（Davis等，2017）。在我们的研究中，蛋白质转运蛋白SEC24的表达在P缺乏时也显着上调，并且在P再补充28小时后下调（图4和5）。因此，内吞作用可能是东海原甲藻捕获细胞外营养素（包括DIP和DOP）的关键途径，并且在DIP缺乏条件下维持细胞内稳态（图4）。
尽管许多基因的表达谱在P缺乏细胞中显着改变，但这些基因仅在少数代谢过程中显着富集（p≤0.05），例如醚脂代谢，甘油磷脂代谢和胞吞作用（图4）。磷脂分解代谢的增强可能为P缺乏时的东海原甲藻提供细胞内有机磷源，而内吞作用不仅提供了P的来源，而且还将细胞外氮和碳源转运到细胞中（图4）。因此，尽管由于P缺乏抑制细胞增殖，但细胞可以存活。与其他浮游植物物种相比，东海原甲藻可能具有特别强大的有机磷利用能力。
2 东海原甲藻对DIP和DOP再补充的差异反应
为了研究东海原甲藻对不同形式P源的即时反应，比较了DIP和DOP再补充4小时和28小时后的生理和转录组学反应。虽然东海原甲藻对DIP或DOP补体的生理反应没有显着差异，但这些在转录水平上有显着差异。如有机磷利用和RNA剪接等对P有直接需求进程中的主要基因在DIP再供应的4小时细胞中率先被下调，但在DOP补给4小时的细胞内没有发现变化，这可能是因为DIP比DOP更容易使用（表S4）。P再补充28小时后，与能量代谢和RNA剪接相关的基因开始恢复（表S4）。对代谢途径的进一步分析表明，与P缺乏细胞相比，DOP再补充4小时和28小时后，各种生物过程，如碳水化合物代谢，脂质代谢，核苷酸代谢和转录，均显着改变，而只有过程剪接体，RNA转运，mRNA监测途径，糖酵解，光合作用和氧化磷酸化在DIP再供应的28小时细胞中差异显著（表2）。
转录终止后，mRNA前体的选择性剪接是控制基因表达、产生蛋白质多样性并最终影响拟南芥和水稻形状和功能的关键机制。在东海原甲藻中，剪接因子和丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白1的表达在P缺乏条件下下调（图4），并在DIP再补充后28小时上调（图5和表S7）。剪接因子涉及从信使RNA中去除内含子，而富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质在细胞核和细胞质之间穿梭，不仅影响RNA剪接，而且在调节mRNA易位、mRNA稳定性和蛋白质翻译中起关键作用。富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质的磷酸化严重影响它们的移动，这影响它们对前体RNA的识别，剪接复合物的组装和剪接催化。然而，这些基因的表达水平在DOP补给组中没有显着变化（表2）。这些结果表明在直接需要P的RNA代谢过程中DIP比DOP更敏感，这可能是由于DIP比DOP更容易获得。
2.2 碳水化合物代谢
几乎所有植物都可以通过糖酵解将葡萄糖或其他多糖转化为丙酮酸，释放ATP并降低能量。此外，代谢中间体也是合成细胞组分如氨基酸和脂质的前体。在我们的研究中，在DIP再补充后28小时，PFK1和丙酮酸脱氢酶（PD）的表达水平显着下调（图5和表S7）。PFK1参与糖酵解的限速途径，并通过糖酵解直接控制碳流入甘油合成途径。PD是参与细胞葡萄糖代谢的关键酶，有助于将糖酵解代谢途径与柠檬酸循环联合并通过NADH释放能量。DIP再补充后28小时，PFK1和PD表达的下调表明细胞需要额外的能量来激活对P缺乏的反应的多种防御机制，并且在DIP再补给后细胞内能量供应开始恢复（图5和表S7）。Fv/Fm是浮游植物光抑制和营养限制的潜在有价值指标。P缺乏时Fv/Fm下降，P再补充后增加（图1E），然而，光捕获复合物（LHC）基因的表达呈现相反的趋势（表S7）。编码LHC的基因在DIP再供应28小时的细胞中显着下调（图5和表S7）。LHC用作捕光天线，捕获光能并将光能传输到反应中心，将光能转化为植物可利用的化学能。营养胁迫会损害LHC并降低其能量转移率，导致反应中心的激发能量不足，最终导致LHC能量转换效率降低。在DIP再补给后，细胞P压力得到缓解，LHC的传播率恢复（图5）。因此，细胞不需要额外的LHC转录物。然而，在DOP再补给后这些基因的表达没有观察到显着变化，进一步验证东海原甲藻优先使用DIP而不是DOP（图5）。我们的研究结果表明，DIP比DOP更有利于细胞内能量的产生，因为DIP更直接地提供了P源。
2.3 转录
基因表达分别由RNA聚合酶、剪接体和核糖体调节三个主要的阶段组成。 RNA聚合酶是一种负责在转录过程中将DNA中编码的遗传信息复制到RNA的酶。在我们的研究中，控制蛋白质编码基因的mRNA合成的DNA指导的RNA聚合酶II亚基RPB1的转录水平在P缺乏细胞中显着下调，并在DOP再补给后上调（图4和5）。然而，在重新供应DIP的细胞中未观察到RPB1表达的显着变化（图5和表S7）。在真核细胞中，剪接体负责从转录的前mRNA（一类初级转录物）中去除内含子。在缺乏P的条件下，前mRNA剪接因子ATP依赖性RNA解旋酶PRP16，ATP依赖性RNA解旋酶DHX8 / PRP22和ATP依赖性RNA解旋酶DDX46/PRP5的转录量显着降低，并且在DOP再补给后显着增加（表S7）。据报道，木霉属的转录由某些碳代谢因子如碳分解代谢物抑制1调控，这个过程也受环境营养水平的调节，这极大地影响了木霉属的适应和竞争。我们的研究结果表明，P缺乏的东海原甲藻细胞的转录受到抑制（图4），但在DOP再补充后恢复（图5），与DIP不同，DOP也可作为细胞的替代碳源。需要进一步调查以确认DOP的这种可疑作用。
2.4 脂质代谢
ACC催化丙二酰辅酶A的形成，丙二酰辅酶A是参与脂肪酸合成限速途径的必需底物。此外，ACC还严重影响脂质储存和整体能量代谢。在DOP再供应4小时后，AAC基因的表达显着下降（图5和表S7）。在DOP再供应4小时和28小时后，磷脂代谢相关基因的表达水平升高（图5和表S7），表明细胞内P不能满足细胞的营养需求。与补给DOP 4小时的细胞相比，DOP补给的28小时细胞中DEG的数量显着降低，表明在一定程度上减轻了细胞中的P缺乏。然而，在DIP再供应细胞中未发现显着变化，尽管在DIP再供应4小时后DIP迅速消耗，表明DOP不仅为细胞提供了P源，而且还提供了碳源。此外，研究结果表明G-6-P可直接被细胞吸收。总之，这些结果表明磷脂在环境P缺乏条件下为细胞提供了重要的P源（图4）。本研究从转录水平调查了东海原甲藻对环境P缺乏和再补给的分子反应。在东海原甲藻中，编码低亲和性和高亲和力的P转运蛋白基因的表达在P缺乏条件下显着下调，而参与有机磷利用的基因的表达显着上调，表明东海原甲藻对有机磷强大的利用能力。细胞膜磷脂可以作为P缺乏细胞的主要P源，而内吞作用的增强使细胞能够捕获更多的细胞外有机磷。虽然东海原甲藻对DIP和DOP补充的生理反应的差异不显著，在DOP补给细胞中观察到比在DIP补给细胞中显示出更多代谢过程的显着变化。与DOP相比，DIP可以更快速地恢复RNA剪接并补充P缺乏细胞中的能量来源，而DOP提供细胞磷源和碳源使其迅速恢复代谢过程，例如碳水化合物代谢，转录和脂质代谢。此外，P缺乏可能会抑制东海原甲藻的碳利用。总体而言，研究结果表明，东海原甲藻有机磷的多样化利用策略适应低磷环境，DOP可能在东海原甲藻的繁殖形成中发挥核心作用。
