科研 | Industrial Crops & Products：代谢组与转录组揭示三种烟草的代谢多样性与差异基因
编译：菜鸟菠萝，编辑：十九、江舜尧。
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烟草是一种重要的经济农作物，叶片是重要的芳香生物活性化合物（如酚类和生物碱）的来源。在本研究中，采用无偏转录组学和代谢组学方法来鉴定和量化三个东方烟草品种叶片中转录本和代谢物物的个体变化。基于二代测序（NGS）和气相色谱-质谱（GC-MS）技术，检测了多种转录本和代谢产物，并确定了品种之间的代谢多样性。在这三个品种的叶片中鉴定出表达差异最大的基因；其中，与第三个品种相比，这个基因在另外两个品种中过表达。同时，在苯丙氨酸生物分解的关键基因苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因中发现明显的表达差异。转录组学和代谢组学分析结果表明，这三个品种之间的多酚化合物差异很大。同时，还显示出可溶性糖，醇，有机酸，氨基酸和其它代谢产物的统计学差异。在确定烟草品种多样性中整合两种组学数据集为代谢产物的遗传控制提供了重要的依据，并为将来在植物生物技术领域改善烟草特质的研究提供了资源。
论文ID
原名：Comprehensive approaches reveal key transcripts and metabolites highlighting metabolic diversity among three oriental tobacco varieties
译名：综合方法揭示了三种东方烟草品种中突出代谢多样性的关键转录本和代谢物
期刊：Industrial Crops & Products
IF：4.58
发表时间：2020年1月
通讯作者：Apostolos Kalivas & Ioannis Ganopoulos
通讯作者单位：希腊农业组织DEMETER（出自NAGREF）植物育种和遗传资源研究所
DOI号：10.1016/j.indcrop.2019.111933
实验设计
结果
1.转录组学分析
1.1 “ Xanthi 81”和“ Katerini 53”中最大的差异表达（FPKM> 1）基因
鉴定出在“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”之间表达差异最大的基因（表1）。在Nitab4.5_0000194g0060基因中检测到最大的表达差异，该基因在“ Katerini 53”中的表达比“ Xanthi 81”高13.4倍。其基因编码的蛋白质类似于在“ Xanthi 81”品种的烟草毛状体中鉴定到的T-叶绿素，称为T-叶绿素2d。该蛋白属于T-叶绿素家族，由烟草中的多个同源物组成，包括T-叶绿素2，是烟草毛状体中最丰富的基因之一，对镉处理有响应。烟草叶绿素被鉴定为在叶片表面发现的防御性应激反应蛋白，可抑制烟粉虱的感染。与“Xanthi 81”相比，该基因在“ Katerini 53”中上调的事实表明，该品种可能具有多种反应机制。在两个品种之间差异表达的另一个烟草基因Ni-tab4.5_0000194g0070，推测其可能编码另一个T-叶绿素蛋白，但转录本似乎带有终止密码子，并且与T-叶绿素2b不同（GenBank：BAJ25790.1）。发现两个品种之间的第三大差异是编码脂肪氧化酶的基因Ni-tab4.5_0002164g0020。与编码细胞溶解酶受体激酶5（LYK5）的“ Xanthi 81”相比，“ Katerini 53”中的Ni-tab4.5_0000525g0010也显著上调。最后一个基因是Nitab4.5_0000363g0260；BLAST结果表明被翻译成CP12-1蛋白参与Calvin-Benson循环。在烟草中，反义抑制CP12的表达对光合作用本身没有很大影响。但是，反义表达载体的转基因烟草的表型显示出异常的叶片形态，生长，矮化和顶端优势减少。对这些植物进行的进一步的转录组学分析发现，基因表达发生了轻微变化，但某些初级代谢酶，对胁迫做出响应的基因以及参与多胺代谢的基因发生了显著变化，所有这些都表明CP12蛋白的作用更为复杂。
Table 1 Xanthi 81和Katerini 53之间表达差异最大的基因
1.2 “ Xanthi 81”和“ Smirni 3B”中最大的差异表达（FPKM> 1）基因
与“ Xanthi 81”相比，“ Smirni 3B”和“ Katerini 53”中存在三种常见的过表达基因。除了Nitab4.5_0001847g0020.1，另外两个分别为编码LOX 2.1和CP12-1蛋白质的Nitab4.5_0002164g0020.1和Nitab4.5_0000363g0260.1都上调了（表2）。烟草的CP12-1同源物在两者之间表达最多，在“Smirni3B”和“Katerini53”两个品种中的表达值相同（199.9对198），这表明CP12在“Xanthi 81”中低水平表达。目前烟草品种之间CP12的表达差异可能反映了生产力，植物防御力或任何其它尚未确定的途径的差异，这些来可能对烟草育种产生巨大影响。
在“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”之间差异表达最大的一个基因是Nitab4.5_0000200g0190.1（表2）。推测参与HGL-DTGs生物合成相关。HGL-DTG是非常重要的二萜，在几种茄科物种中大量产生。与被抑制（FPKM = 13.6）的“ Xanthi 81”相比，该基因主要在“ Katerini 53”（FPKM = 80）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 76.1）两个品种中高表达。同时，在“ Katerini 53”和“ Smirrni 3B”中也显著诱导了产生香叶基香叶基二磷酸（焦磷酸）（GGPP）的基因的同系物，GGPP是HGL-DTG生物合成的前体。共检测到了三种GGPP合成酶。GGPPS1主要在“ Katerini 53”（FPKM = 82.9）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 89.3）表达，而在“ Xanthi 81”（FPKM = 40.6）中较低的表达。第二个几乎在所有三个品种中平均表达，而第三个几乎不表达。品种之间的这种差异可表明萜类化合物的产量存在差异。然而，在这项研究中，作者没有关注生产的萜类。
Table 2 “Xanthi 81”和“Smirni 3B”之间表达差异最大的基因
2. GO富集差异表达基因
对差异表达的基因进行GO富集分析，以获得GO类别的代表性。共有2620个差异表达基因用于三种基因型的富集分析（图1）。在生物过程类别中，主要与超氧化物酶代谢，精氨酸分解代谢，苹果酸代谢和多胺生物合成有关（图1）。分子功能类别中的富集类别为硫氧还蛋白活性，固醇结合，L-苏氨酸氨裂解酶活性和富马酰乙酰乙酸酶活性。在细胞成分类别中，主要为高尔基体堆积，小亚基加工体，细胞外间隙和1,3-β-D-葡聚糖合酶复合体。
Fig 1 Go富集分析三个品种中与生物过程相关的差异表达基因
3. 苯丙烷类生物合成
在大多数植物中，苯丙烷的生物合成从L-苯丙氨酸转化为肉桂酸酯（或肉桂酸）开始，并形成多种多酚（图2）。其中有四分之二的在所有品种的叶片中均高表达，剩余的则表达较少（图2）。PAL1（Ni-tab4.5_0000754g0260.1）在所有品种中表达最高，其次是PAL4（Nitab4.5_0000101g0270.1）。与其它两个品种的叶子相比，在“ Katerini 53”中两个PAL基因都检测到高表达。而在结果中仅发现了一个低丰度肉桂酸基因（C4H），而该基因在“Katerini 53”中仍被上调。另一方面，有多个CoA-连接酶（4CL）基因，除了其中两个外，大多数基因低表达。Ni-tab4.5_0002394g0060.1和Nitab4.5_0001842g0060.1在“Xanthi 81”叶片中均上调。这两个基因可能是两个不同的等位基因，因为它们与同一基因具有高度同源性（NCBI基因ID：107783543，草酸-CoA连接酶类似）。这些基因有助于将苯丙氨酸转化为4-香豆基辅酶A，这是一种重要的中间体，可作为下游许多产物合成的前体。HCT/HQT和C3H这两个基因参与了CGA的合成。在结果中后者几乎没有表达。但检测到3个高表达的HCT/HQT。其中两个（Ni-tab4.5_0002724g0070.1和Nitab4.5_0002320g0020.1）是烟草hqt基因的不同等位基因（NCBI：NP_001312079）。两者在“Xanthi 83”中均被上调。HQT优选结合奎宁酸酯而不是草莽酸以产生CGA。本氏烟草中HQT基因的过表达显著提高了CGA的产量。第三个为Nitab4.5_0001271g0010.1是从烟草茎中纯化的HCT基因（NCBI：NP_001312552），被发现可催化CGA和木质素的合成，但是，该基因表达不足，品种间没有明显差异。
Fig 2 苯丙烷和类黄酮途径的示意图，以及参与该途径的相关基因的表达值
3.1黄酮醇
查尔酮合酶（CHS）是类黄酮生物合成中的关键酶。我们发现两个CHS基因在三个烟草品种的叶片中均低表达，因为CHS主要在花中组成性表达，但其表达主要是由非生物/生物胁迫诱导的。注释为CHS-1B或CHS2的Nitab4.5_0002920g0060.1在'Katerini 53'和'Xanthi 81'中略有上调，但第二个注释为III型聚酮化合物合酶（NCBI：XP_016446648.1）差异很小。所有CHI基因也仅以低水平表达，在鉴定的结果中F3H也没有差异。另一方面，鉴定了两个参与黄酮醇形成的FLS基因。FLS1（Nitab4.5_0005357g0020.1）（NCBI：LOC107794305）的表达最高，而NtFLS（Ni-tab4.5_0006276g0010.1）的表达低得多。这两个基因在品种之间没有差异表达。还检测到有助于花色苷生物合成的基因，例如DFR和ANS。DFR中第一个仅适度表达，另外一个没有差异。ANS（Nitab4.5_0003274g0110.1）几乎未表达（图2）。芦丁是一种黄酮醇糖苷，在花青素途径生物合成，其中包括黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶和黄酮醇3-O-葡萄糖苷胰岛素转移酶。结果表明低表达的4种黄酮醇3-O-糖基转移酶和2种黄酮醇3-O-糖苷胰岛素转移酶在“Smirrni 3B”和“Xanthi 81”比“Katerini 53”中表达更高、更多（图2）。
研究结果表明，在两个PAL基因的表达中检测到品种之间的显株差异。与其它两个基因相比，“Xanthi 81”中的基因表达不足，这可能意味着该品种中向CGA的苯基-丙烷途径的产物通量不同，因为当烟草中PAL过度表达时，PAL活性及其含量显著更高，其后的CGA浓度比芦丁更高，这意味着更多的产物被转移至该选择性途径。具有显著较高的CGA含量的烟草植物中PAL含量的升高也与真菌感染的易感性降低有关。
4. 代谢组学分析
采集“Katerini 53”，“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”叶片样品，并使用气相色谱GC-MS和LC-MS / MS方法进行代谢分析。基因型预先鉴定为不同的色谱模式，共有78种代谢化合物（包括糖，氨基酸，有机酸）差异积累，如图3所示。详细的非靶向GC-MS代谢组学分析用于鉴定烟叶中产生的大多数主要代谢产物。在本研究中，所测得的最丰富的可溶性糖是果糖，葡萄糖，半乳糖和蔗糖。在果糖和蔗糖中检测到统计学差异；“Katerini 53”中的果糖含量更高，而“Smierni 3B”中的蔗糖含量更高。“Katerini 53”与其它两个品种相比葡萄糖和半乳糖水平较高，差异无统计学意义（图4A）。在可溶性醇中，两个丰富的代谢产物是山梨糖醇和肌醇，但在品种之间未检测到统计学上的显著差异（图4B）。这三个品种中的苹果酸含量没有任何统计上显著不同（图4D）。“Xanthi 81”叶子的氨基酸含量最高，但谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）除外。GABA和脯氨酸是烟叶中的主要氨基酸。与其他两个品种相比，“Smirrni 3B”中的GABA水平明显更高。'Smirrni 3B'和'Xanthi 81'中的脯氨酸水平较高，而“Katerini 53”的脯氨酸水平最低。在“Smirrni 3B”中检测到了高浓度的甘氨酸和丝氨酸这两种必需氨基酸。烟草生物碱在根部合成，然后转运到叶片。生物碱、尼古丁与植物抗草食动物防御有关。在三个品种中检测到的尼古丁浓度在统计学上有显著差异。结果表明，“Xanthi 81”的尼古丁浓度最高，而“Smirrni 3B”的尼古丁浓度最低（图4C）。与“Katerini 53”相比，“Xanthi 81”中腐胺的含量有所降低，但其浓度仍高于“Smirrni 3B”。鉴定了所有拟参与烟草中尼古丁生物合成的相应基因，但仅发现少数几个在成熟叶片中表达。然而，基因XS和QPT（三分之二）在“Xanthi 81”中表达较高。与其它两个品种相比，这与“Xanthi 81”叶片中较高的尼古丁含量相关，这表明它可能是遗传控制的。
4.1 多酚类分析
植物酚类物质参与植物系统的各种功能，包括色素沉积和防御。烟叶富含多酚，具有多种生物活性。CGA，东莨菪碱和芦丁是烤烟叶片中的主要多酚。CGA占烟草中酚类总量的60％，而芦丁占10％。通过对三个烟草品种的针对性LCeMS / MS分析，鉴定了26种多酚成分。苯甲酸衍生物，苯丙酸酯等。在这三个品种中最突出的化合物是CGA，两个异构体隐绿原酸（4-O-咖啡酰奎尼酸或4-CQA），新绿源酸（5-O-咖啡酰奎尼酸或5-CQA），芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷（烟碱苷）。还检测到了较低浓度的东莨菪素（6-甲氧基-7-羟基-香豆素），瑞香素，苯丙烷和类黄酮。这些发现与先前有关烟草主要定性多酚指纹图谱的报告一致。在较低浓度的鞣花酸中，样品中也检出了1.5二咖啡酰奎尼酸和咖啡酸。在“Xanthi 81”和“Smyrni 3B”品种发现的对苯二酚O-β-D-葡萄糖苷，属于可溶性酚类。该代谢产物具有抗药性，因为它是一种抑制酪氨酸酶的酶，酪氨酸酶是一种抑制黑色素生成的酶，是一种抗氧化剂，抗微生物，消炎剂。
总体而言，烟草多酚在这三个品种中差异很大。对数据进行统计分析，结果表明在三个品种之间多酚成分的含量存在显著差异（图5）。“Katerini 53”的CGA，5-CGA和4-CGA含量显著更高，尽管对于后者的化合物，仅与“Smirni 3B”相比，差异才具有统计学意义（图5A）。
如上所述，“Xanthi 81”中两个HCT/HQT基因高表达，但与“Katerini 53”相比，其叶片中的CGA浓度较低。另一方面，HCT/HQT基因的高表达可能由于前体的限制而导致更多的产物形成。“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”中的香豆素衍生物，瑞香碱和莨菪碱等被下调。两类主要的类黄酮，即黄酮和类黄酮，起着保护细胞免受UVeB辐射的作用，因为它们聚集在叶片的表皮层中，并在UVeB区域强烈吸收光。NAR是一种黄烷酮，是所有下游类黄酮类（包括黄酮醇）的前体。“Smirni 3B”中NAR比“Xanthi 81”高出四倍。香草醛，一种低分子量的酚类化合物，具有抗氧化和抗微生物特性。在“Smirni 3B”中发现了高含量的香草酸和香草醛，分别比其它品种含量高3.5倍和4.26倍。先前的研究表明，HCHL基因的转基因烟草品系显示CGA和芦丁的消耗高达93％和82％，而以前无法检测到的香草酸和香草醇的含量却上升了。与这些结果相吻合的是，“Smirni 3B”中的香草醛和香草酸含量高，而CGA，东莨菪素和芦丁含量低。此外，“Smirni 3B”的咖啡酸含量比“Katerini 53”高3倍，并且含量也高于“Xanthi 81”（图5B），这些差异具有统计学意义。“Xanthi 81”中的芦丁浓度较高，但仅与'Smirni 3B'（图4C）相比具有统计学意义，在'Katerini53’叶提取物中，主要的香豆素-东莨菪碱积累量较大（图5D）。在三个品种中似乎仅黄素醇-3-O-葡糖苷胰岛素转移酶差异表达，这可能与仅在“Xanthi 81”和“Smirni 3B”中芦丁各自浓度的差异有关。烟碱在“Xanthi 81”中检出的浓度较高，但与其他两个品种没有显著差异。
Fig 5 三种烟草的甲醇提取物中最主要的多酚化合物（A）绿原酸（CGA），（B）咖啡酸，（C）芦丁和（D）东莨菪碱的含量
结论
本研究为理解和解释芳香型烟叶中代谢物的积累与基因型之间的相互作用提供了新的见解。转录组学和代谢组学数据整合是一种有价值的工具，可用于评估转录本丰度与代谢产物生产丰度的比较。代谢组学清楚地表明芳香烟草叶的品种依赖性，代谢谱受自然遗传变异的强烈影响，从而为今后构成了用于植物生物技术领域以改善烟草特定性状的研究资源。
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