科研 | 剑桥大学：炎症信号诱导AT2细胞源性损伤介导肺泡再生

编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

组织再生是受多样的细胞层次和状态调节的多步骤过程，这些细胞的层次和状态同样影响组织的异常调节和发病机制。在本研究中作者将单细胞RNA测序技术与体内线性轨迹和类器官模型结合以更好的绘制肺泡谱系细胞在损伤修复和肺再生过程中的轨迹。研究者确定了一个不同的AT2谱系的群体，损伤相关的短暂性祖细胞DATPs在肺泡再生过程中升高。研究者发现组织间隙巨噬细胞源性IL-1b准备了一组表达Il1r1的AT2细胞，通过一个HIF1a调节的糖酵解通路转变为DATPs，这对于成熟AT1细胞的分化是必需的。重要的是，IL-1b介导的慢性炎症反应能够抑制AT1分化，导致DATPs的异常聚集以及肺泡再生受损。总之，对细胞命运转变的逐步绘制展现了炎症灶如何通过控制干细胞命运和行为来调节肺泡再生。

论文ID

原名：Inflammatory Signals Induce AT2 Cell-Derived Damage-Associated Transient Progenitors that Mediate Alveolar Regeneration

译名：炎症信号诱导AT2细胞源性损伤相关的短暂性祖细胞介导肺泡再生

期刊：Cell Stem Cell

影响因子：20.86

作者：Joo-Hyeon Lee

单位：剑桥大学

DOI号：10.1016/j.stem.2020.06.020.

前言

组织内稳态以及损伤后修复的维持依赖于成人干细胞的功能。在肺中，上皮屏障完整性对于防止感染和有效的气体交换是非常重要的。肺组织在稳定的状态下细胞转换很慢，但是坐落有区域特异的干细胞，能够在组织损伤后迅速的动员起来以修复上皮。在肺泡中，AT2细胞维持肺稳态并且能够通过增殖和分化成新的对气体交换特异的AT1细胞维持再生。考虑到AT2细胞的重要性，它们的自我更新和分化必然与维持组织的完整性与有效修复紧密相关。破坏这种平衡可能导致危及生命的肺疾病。近期的研究表明信号通路包括参与AT2增殖和分化调节的通路。然而损伤驱动了哪个因子引发静止的AT2细胞分化成AT1细胞并且在肺再生过程中它们遵循的分化轨迹是哪个尚不明确。

组织修复是包括干细胞和它们对应位置之间动态交流的复杂过程。生理损伤包括病毒感染、通过引发免疫细胞活化或者招募到受影响组织位点的煽动性炎症。在实心组织中，先天性的或者获得性的免疫中多样的免疫细胞是病灶中完整的部分，在免疫防御感染并且识别环境中的刺激中发挥重要的作用。除了清除病原体，近期的研究强调了如何恢复上皮器官屏障的完整性，例如受到破坏的皮肤、肠、肺都依赖于免疫系统。肺上皮特别的容易收到损伤，因其表面暴露在外面的环境中。与此对应的，已经报道免疫细胞参与肺稳态和恢复。最近的研究进展使我们更加深刻地认识到旁分泌灶产生的信号在干细胞行为调节中扮演的重要角色。在远端肺部，Pdgfra+间质细胞以及血管内皮细胞已经被确定为支持灶的细胞。近期，包括Wnt应答以及Wnt产生成纤维细胞在内的间质细胞亚群已经报道可以调节干细胞的特性以及AT2细胞的命运。然而，在重生中炎症细胞和AT2细胞之间的特异交流仍然不清楚。特别的是，有一个仍然需要探究的基础问题：慢性炎症是如何影响组织破坏的，它似乎是由损伤后干细胞功能或者重生过程受损导致的，而这一过程了解甚少。

在本研究中研究者着手于确定损伤后肺泡再生过程中从AT2到AT1细胞的谱系轨迹。对体内AT2谱系标记细胞以及离体的AT2细胞源性类器官进行scRNA-seq，使得研究者可以确定一个准确的分化轨迹，AT2细胞选取一个启动的状态，转换至DATPs，最终分化为AT1细胞。重要的是，研究者发现IL-1b和Hif1a信号通路驱动的炎症灶通过引发AT2谱系细胞状态特异的分化程序调节再生过程。总之，研究者的结果揭示了在肺泡再生中炎症的重要功能，阐释了慢性炎症如何损伤组织修复并且导致肺部疾病。

结果

组织损伤后肺泡再生过程中AT2细胞重编程

为了确定响应损伤并进行再生的AT2谱系细胞的分子身份和状态，研究者利用他莫昔芬处理AT2报告小鼠(SPC-CreERT2;R26RtdTomato) ，将它们暴露在PBS或者博莱霉素（损伤），并且对14天和28天分离的谱系标记的细胞进行scRNA-seq分析（图1A）。基于经典的AT1和AT2细胞标记物的表达，研究者发现了5个不同的细胞群体（图1B）。依据时间点对每个集簇进行分布使研究者能够评估AT2细胞在损伤应答和修复中是如何变化的（图1C）。

如所期盼的一样，在未损伤的小鼠中谱系标记的细胞主要包括AT2细胞（集簇1），表达经典的AT2标记物，如表面活性剂的蛋白(Sftpc和Sftpa1)（图1C、1D）。在损伤后14天，有另外三个不同的群体出现，而AT2集簇显著减低（图1C、1D），大约有6%的谱系标记的细胞表达细胞周期标记物如Cdk1, Mki67, Cenpa,与循环中的AT2(cAT2)细胞（集簇3）对应（图1D）。第二个AT2样状态在集簇2中占主导，这一集簇中经典的AT2标记物包括Sftpc表达水平相当，但是低表达内稳态AT2(hAT2)细胞（集簇1）中参与脂代谢的基因，例如Acly, Hmgcr，Hmgcs1（图1D）。研究者同样发现参与炎症反应的基因表达较高，包括Ptges, Lcn1, Orm1,Tmem173, 以及Ifitm2/3（图1D）。显著的是，对AT2谱系特异性的关键调节因子，包括Etv5, Abca3, Cebpa是下调的，提示这些群体丧失了AT2的身份，是一个待发的AT2（pAT2）状态。此外，集簇2的细胞与cAT2细胞的转录特征相似，除了细胞周期相关的基因。研究者也发现了没有特点的细胞群体集簇4，将其命名为损伤相关短暂性祖细胞（DATPs）。DATPs表达特异的标记物例如Cldn4, Krt8, Ndrg1, Sprr1a,以及AW112010（图1D）。总之，DATPs具有AT1谱系转录的特征，但是经典的AT1标记物如Pdpn, Hopx, Cav-1表达水平较低（图1D）。GO条目的分析进一步发现DATPs与p53信号通路、增殖抑制、缺氧以及γ干扰素相关的基因表达显著升高。

如所期盼的一样，在损伤后第28天，研究者观察到成熟的AT1和hAT2群体中升高，而cAT2, pAT2以及DATPs消失，反应了损伤后肺泡回到内稳态（图1C）。为了更好的理解在重生过程中AT2细胞到AT1细胞的分化路径，研究者利用PAGA（图1E）并且沿着伪时序轨迹描述了转录程序（图1F）。PAGA的结果发现AT2和AT1细胞通过包括pAT2细胞和DATPs的轨迹相连（图1E）。cAT2细胞被认为是最接近pAT2的群体，这也提示自然的AT2细胞在发动分化之前与细胞周期事件紧密联系。在排除cAT2细胞后，伪时序分析发现AT2通过pAT2和DATPs转变成AT1细胞，这与PAGA中的结果一致（图1F）。总之，这些发现AT2到AT1细胞命运的分化轨迹需要在重生过程中通过不同的pAT2和DATP细胞。

图1 scRNA-Seq揭示在损伤后肺泡再生过程中AT2到AT1细胞的谱系轨迹

组织间隙巨噬细胞分泌的IL-1b引发了AT2细胞的重编程

由于研究者的结果发现在pAT2细胞中与免疫应答相关的基因表达升高，研究者进一步探究了博莱霉素损伤是否会导致炎症。通过流式分析，研究者发现围绕损伤应答和再生巨噬细胞发生显著的变化。在损伤后第七天，组织间隙巨噬细胞（IMs）的数量和频率显著升高，而肺泡巨噬细胞(AMs)降低。这些变化在28天时恢复到稳态，提示急性炎症得到解决。由于巨噬细胞在急性损伤过程中靠近AT2谱系标记的细胞，研究者猜想在应答损伤过程中巨噬细胞可能影响谱系标记细胞的行为。重要的是，将AT2细胞与基质细胞IMs通过3D类器官共培养发现与AMs共培养相比能够形成更多更大的类器官。为了进一步解释损伤后肺泡再生中巨噬细胞的作用，研究者对SPCCreERT2;R26RtdTomato小鼠中非谱系标记的细胞进行scRNA-seq分析，包括免疫细胞，与样本平行分离。IL-1b的表达水平能够在巨噬细胞中被特异的检测到，在损伤后14天升高并且在28天降低到内稳态的水平。对从未损伤肺中分离得到的AMs和IMs进行qPCR分析，结果发现IL-1b在AMs中富集，与之前的报道一致。此外，粒细胞——巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)的活化能够特异的扩大IMs中IL-1b的表达，但是不影响AMs中IL-18的表达。显著的是，博莱霉素损伤在体内IMs中刺激IL-1b的表达。IL-1b的处理同样足以提高AT2细胞形成的类器官的数目和大小（图2D、2E）。

为了探究IL-1b如何影响AT2细胞细胞内分子行为，研究者对对照组和IL-1b处理的类器官进行了scRNA-seq。基于标记物的基因表达，研究者确定了5个不同的群体(AT2, pAT2, cAT2, DATPs, AT1 cells)，与AT2谱系标记细胞中观察的结果一致（图2F）。在对照组类器官中，大多数细胞类型与AT2和AT1细胞对应，并且具有较小的pAT2和DATPs群体（图2G）。相反IL-1b处理能够提高pAT2的比例到77%，由低表达的基因如Etv5, Abca3, Cebpa区分，提示IL-1b能够引发AT2细胞进入一个待发的状态（图2G）。IL-1b处理后DATP群体也是升高的（图2G）。对scRNA-seq数据进行伪时序和PAGA分析发现IL-1b处理的类器官偏向由AT2细胞到AT1命运的分化（图2H），与体内那些重生的AT2细胞一样提高分化进入pAT2和DATP状态。为了研究IL-1b是否能够直接影响AT2细胞命运转变，研究者检测了在类器官形成过程中两个关键的分化时间点第6天和第14天细胞内状态。在第6天，IL-1b处理的类器官进行qPCR分析发现，与对照组类器官相比，pAT2状态的转录特征增强（图2I）。此外，第14天对DATP标记物如Krt8和Cldn4免疫印迹和流式细胞术分析发现，在IL-1b处理的类器官中DATPs显著升高（图2J、2K）。这些结果说明在AT2类器官中IL-1b处理概括了体内肺再生的重要方面。总之研究者的数据说明IL-1b调节的炎症灶能够在肺泡再生过程中通过分化程序产生DATPs引发AT2调节的损伤应答。

图2 IL-1b信号通路直接促进AT2细胞的重编程

在损伤后肺泡再生过程中DATPs分化成AT1和AT2细胞

研究者的scRNA-seq分析发现在肺泡再生过程以及IL-1b刺激的类器官中未知的AT2谱系衍生的DATP群体出现。利用AT2受体小鼠(SPC-CreERT2;R26RtdTomato)，研究者发现在博莱霉素损伤后第14天大约10%的AT2谱系标记的细胞表达Krt8，证实DATPs最初直接从AT2细胞中获得（图3A-3C）。重要的是，在这一群体中既没有检测到AT2标记物SPC也没有检测到AT1标记物(Pdpn)（图3B、3D）。为了进一步评估DATPs对肺泡再生的功能作用，研究者建立了Ndrg1的种系报告小鼠(Ndrg1-CreERT2;R26RtdTomato)，在肺泡再生过程中的DATPs中特异表达（图1D、3E）。研究者在损伤或者未损伤的气道上皮细胞中并未检测到Ndrg1的表达（图3F）。与scRNA-seq的结果一致，在PBS对照小鼠中AT2和AT1细胞都没有被Ndrg1的表达标记（图3G）。然而，在博莱霉素损伤后第9天肺泡区Ndrg1谱系标记的细胞出现并带有大部分对Krt8阳性的细胞（图3H、3I）。在第28天，研究者发现大于30%的AT1细胞被Ndrg1谱系标记并且带有AT1细胞形态（图3J、3K）。研究者也证实利用Krt8报告小鼠(Krt8-CreERT2;R26RtdTomato)的谱系轨迹分析发现在AT1细胞生成中DATPs的作用。与Ndrg1谱系标记的细胞一致，在未损伤的肺中AT2细胞和AT1细胞都没有标记。Krt8的表达也只在损伤后肺泡区域第9天Cldn4+ DATPs中检测到，随后在第28天在Pdpn+ AT1中占主导。

研究者也观察到在博莱霉素损伤后第28天被Ndrg1和Krt8谱系标记的SPC+ AT2细胞数量很多（图3J、3L）。为了证实DATPs具有去分化为AT2细胞的能力，研究者从Krt8报告小鼠中分离了AT2细胞（CD31-CD45- EpCAM+MHCII+）并且在IL-1b存在时进行类器官培养。在培养的第14天，研究者添加了4-OH他莫昔芬以标记Krt8-表达的DATPs。与类器官中Krt8的免疫印迹一致，研究者在类器官的中心位置检测到了Tomato+细胞(Krt8+ DATPs)，从Tomato- MHC class II+ AT2细胞中分离得到，并且通过流式细胞术进行分析。此外从类器官中分离得到的Krt8+ DATPs（Tomato+MHCII-）也能形成由DATPs和SPC+ AT2细胞构成的类器官。

图3 损伤应答特异的DATPs是从AT2细胞产生的并且能够调节AT1的谱系分化

IL-1b信号通路是肺泡再生过程中细胞命运转换成DATPs所必需的

考虑到IL-1b处理能够提高类器官中DATPs的生成，研究者进一步思考IL-1b是否是体内分化成DATPs所必需的。为了解释这一问题，研究者构建了Il1r1flox/flox;SPC-CreERT2;R26RtdTomato的小鼠以敲除Il1r1, IL-1b的功能受体，在AT2细胞中特异表达（图4A）。Il1r1不足的AT2细胞的增殖活性与损伤后Il1r1单倍体缺失的AT2细胞相当。由于IL-1b处理能够提高类器官的大小和形成效果（图2D、2E），研究者在类器官培养的早期时间点（第4天）通过EdU结合试验检测了AT2细胞的增殖。尽管IL-1b处理的类器官能够提高EdU结合的比率，重要的是，Il1r1不足的AT2细胞也表现出相似的比率。考虑到在IL-1b处理的基底细胞与类器官中的AT2细胞共培养中，调节AT2细胞增殖生长因子的差异表达，很有可能IL-1b能够通过调节周围的细胞提高AT2细胞的增殖，而不是直接影响AT2细胞。

研究者接下分析了cAT2亚群，基于细胞周期间期特异基因的表达表现出细胞周期转变。研究者发现AT2细胞在细胞周期S到G2/M转变中需要pAT2细胞转录特征。在这一转变过程中，自然的AT2细胞标记物包括Abca3的表达下调，而与炎症反应相关的基因如Ptges表达产生。重要的是Il1r1的表达在G2/M期特异上调。研究者发现Il1r1不足的AT2细胞在损伤后第10天难以分化为DATPs（图4B、4C）。随后，谱系表达的AT1细胞在损伤后第21天显著降低，提示在缺乏IL-1b信号通路时AT2细胞分化为AT1细胞受损（图4D、4E）。总之，这些发现提示IL-1b并不直接影响AT2细胞的增殖特性，相反，在肺泡再生过程中准备AT2细胞以起始细胞命运转变为DATPs。

图4 IL-1b驱动Hif1a信号通路诱导的DATPs是肺泡再生的重要调节因子

Hif1a信号通路是DATP细胞转变和AT1分化所必需的

在接下来的研究者，研究者探究了哪个IL-1b驱动的下游转录因子以及信号分子是DATP分化所必需的，对体内和体外scRNA-seq的数据进一步分析，研究者发现一条特异的代谢特征，伴随有参与糖酵解信号通路基因的高表达，如Pgk1, Pkm,以及Slc16a3（图4F）。通过测量类器官中的ECAR，研究者发现IL-1b能够提高糖酵解代谢。IL-1b处理的类器官也发现葡萄糖摄取的比率更高。重要的是，一个有氧糖酵解代谢的关键调节因子Hif1a的表达在DATPs中富集（图4F）。为了确定Hif1a信号通路是否是转变成DATPs所必需的，研究者在IL-1b存在时利用地高辛处理AT2类器官抑制Hif1a的活性（图4G）。培养的第六天，当pAT2细胞的基因表达更高时，地高辛处理的类器官DATPs和AT1细胞的生成受损（图4H、4I）。研究者接下来在AT2细胞中利用Hif1aflox/flox;SPC-CreERT2;R26RtdTomato小鼠特异性的敲除了Hif1a，与类器官的结果一致，Hif1a缺失的AT2细胞在受损的第十天不能产生DATPs。与Il1r1不足的AT2细胞类似，缺乏Hif1a的AT2细胞也不能分化为AT1细胞。总之，这些结果说明IL-1b能够提高Hif1a介导的糖酵解代谢的改变，这是在损伤修复过程中转变为DATPs以及随后分化为AT1细胞所必需的。

Il1r1+AT2细胞是功能和表观上都不同的亚群，在肺泡再生过程中通过IL-1b信号产生DATPs

由于IL-1b信号通路在肺泡再生中的重要性，研究者猜想是否所有的AT2细胞都具有响应IL-1b炎症信号的能力。为了解释这一问题，研究者构建了Il1r1的报告小鼠(Il1r1-CreERT2;R26RtdTomato)并且利用他莫昔芬处理Il1r1表达细胞的谱系轨迹（图5A、5B）。研究者发现在未损伤的肺气道纤毛细胞和间质细胞小的亚群中表达Il1r1（图5C）。显著的是，在未损伤的肺中大约15%的AT2细胞是谱系标记的（图5D、5E）。然而博莱霉素损伤在损伤后第14天谱系标记的AT2细胞高达60%的群体显著升高（图5D、5E）。Il1r1谱系标记的AT2细胞具有更强的增殖能力（图5F、5G）。大约80%的DATPs被Il1r1谱系标记，提示DATPs主要来源于Il1r1+AT2细胞（图5H、5I）。在损伤后第28天，可以清楚的观察到谱系标记的AT1细胞（图5J）。

图5 Il1r1+AT2细胞是损伤后肺泡再生过程中能够产生DATPs的不同群体

研究者假定表观遗传学的机制可能形成了Il1r1+AT2细胞的活化应答并且进行了ATAC-seq。尽管包括AT2标记物和常见的管家基因在内的大部分基因表现出相似的染色质开放性图谱，在Il1r1+AT2细胞的开放染色质状态下显著不同（图6A、6B）。对GO条目中分布最高的基因进行分析发现表观调控以及炎症相关信号通路，包括IL-1信号通路在Il1r1+AT2细胞中富集（图6C、6D）。对DNA结合位点的基序分析发现Il1r1+AT2富集的染色质包含与炎症相关重要转录因子的基序，例如AP-1, CREB，NF-kB以及Rorc。共同的基因在对肺发育的因子如Nkx2.1和Cebp等的基序上富集。总之，这些结果说明Il1r1的表达标记着表观层面不同的AT2细胞亚群在损伤应答过程中具有快速扩增并且随后分化为AT1细胞的能力。

图6 Il1r1+AT2细胞具有染色质装置能够快速应答损伤

持续的IL-1b水平调节的慢性炎症中止DATPs转变为成熟的AT1细胞

尽管早期AT1标记物如Lmo7, Pdpn, 以及Hopx的表达水平在对照组和IL-1b处理的类器官组中相当（图7A），研究者发现在IL-1b处理的类器官中AT1样细胞的存在在对照AT1细胞中不能提高成熟AT1标记物的高表达，例如Aqp5, Vegfa, Cav-1, Spock2（图7B）。相反，在IL-1b处理的类器官中AT1样群体高表达DATP相关的基因，包括Cldn4, AW112010, Lhfp（图7C），提示在AT2类器官中持续的IL-1b处理能引起DATPs聚集并且阻止最终分化为成熟的AT1细胞。研究者随后猜想向成熟AT1细胞中止的转变可能是通过减轻IL-1b调节的炎症进行补救。研究者将AT2类器官与IL-1b共培养14天，并且维持7天没有IL-1b处理（图7D）。的确，研究者发现晚期AT1标记物的表达在IL-1b撤销后显著升高，同时伴随有DATP标记物、Hif1a表达以及其他糖酵解信号通路基因的下调（图7E）。这些结果促使研究者猜想在中止的DATPs中糖酵解的抑制是否会促进AT1细胞的成熟。为了这一目的，研究者将AT2类器官用IL-1b进行了14天的处理并且随后用糖酵解抑制剂2-DG处理4太难（图7F）。显著的是，抑制高糖代谢能够显著上调成熟AT1标记物的表达（图7G）。利用免疫印迹，研究者证实IL-1b持续的处理AT2细胞不能产生表达Cav-1的成熟AT1细胞，Cav-1是AT1细胞的晚期标记物，而AT1细胞的早期标记物Hopx的表达与对照组中观察到的相当（图7H）。重要的是，2-DG处理的类器官能够在IL-1b存在时补救受损的AT1细胞成熟（图7H）。

图7 IL-1b驱动的糖酵解途径能够阻止DATPs转变为成熟的AT1细胞

研究者猜想慢性炎症的环境可能导致DATPs的逐步累积，并且最终导致不完全分化以及肺再生下降。近期利用高分辨率的scRNA-seq分析发现，转录层次不同的KRT17+群体在非许可性病理环境中异常聚集，例如伴随有特发性肺纤维化(IPF)。与近期研究报道一致的是，研究者发现大多是标记物是对KRT17+细胞特异的并且在DATPs中高表达。的确研究者在IPF病人组织样本的肺泡区域观察到大量的KRT8+CLDN4+ DATP-样细胞接近HTII-280+ AT2细胞，但是在正常捐献者的肺泡中没有（图7I-K）。此外，考虑到慢性炎症与肺癌之间的关系，以及近期的报道在肺癌细胞中损伤应答的转录特征，研究者也发现KRT8+CLDN4+ DATP样细胞能够在肺癌病人组织样本中观察到。总之，这些结果提示慢性炎症信号导致DATPs的异常调节，这将导致人类肺部疾病的发生发展。

结论

在本研究中研究者着手于确定损伤后肺泡再生过程中从AT2到AT1细胞的谱系轨迹。对体内AT2谱系标记细胞以及离体的AT2细胞源性类器官进行scRNA-seq，使得研究者可以确定一个准确的分化轨迹，AT2细胞选取一个启动的状态，转换至DATPs，最终分化为AT1细胞。重要的是，研究者发现IL-1b和Hif1a信号通路驱动的炎症灶通过引发AT2谱系细胞状态特异的分化程序调节再生过程。总之，研究者的结果揭示了在肺泡再生中炎症的重要功能，阐释了慢性炎症如何损伤组织修复并且导致肺部疾病。

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