编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
糖酵解和线粒体呼吸之间的生物能量平衡对干细胞命运的特异性特别重要。然而未分化的精原细胞在分化过程中是否转向生物能量产生尚未确定。在本研究中研究者发现精原细胞中ATP的产生在视黄酸(RA)诱导分化后逐渐升高。为了适应能源需求的增加，RA信号同时将精原体内ATP的产生从糖酵解转变为线粒体呼吸，伴随着活性氧含量的增加。破坏线粒体呼吸显著阻断了精原细胞分化。抑制葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸或磷酸戊糖信号通路也抑制了c-Kit+分化生殖细胞的形成。糖酵解的代谢产物是精原细胞分化所必需的。研究者进一步通过RNA-seq和蛋白组学定量分析证实一些代谢调节因子和酶的表达水平在RA诱导分化后显著改变。总之研究者的结果证实在糖酵解和线粒体呼吸之间严格调控的生物能量平衡是精原细胞增殖和分化所必需的。
原名：A bioenergetic shift is required for spermatogonial differentiation
译名：精原细胞分化需要生物能量转换
期刊：Cell discovery
影响因子：6.255
作者：Yuan Wang
单位：华东师范大学
发表时间：2020年8月18日
DOI：10.1038/s41421-020-0183-x
精原干细胞(SSCs) 在精子发生以及出生后生殖细胞发育过程中维持着一些未分化的精原祖细胞。在这一过程中，未分化的精原细胞瞬时增殖并且对发育中的因素例如RA作出应答，成为分化的精原细胞，并进一步发育为精母细胞并且通过减数分裂形成单倍体精子。因此理解精原细胞增殖和分化是如何平衡的对于维持适当的精子发生是非常重要的。在成年小鼠中SSCs是稀少的并且只占生殖细胞群的~0.03%。相反体外培养的精原细胞能够长期增殖，并且为基因和环境对出生后生殖细胞发育的研究提供了可行的平台。CD90和CD9表面抗原通常富集在未分化精原细胞以及高表达标记物基因，如ID4,GFRα1, PLZF等的SSCs上。C-Kit的表达标志着分化的精原细胞以及早期精母细胞的出现。FGF2和GDNF是维持精原细胞增殖所必需的，而RA处理后，CD90+/CD9+/c-Kit−精原细胞开始分化为c-Kit+细胞，该细胞中STRA8和SYCP3是上调的。具有SSC能力的未分化精原细胞能够进一步通过睾丸外植体到Kitw/w-v小鼠中评估其减数分裂以及再生完整的精子发生的潜能，该模型是通常应用的内源生殖细胞发育缺陷的受体小鼠模型。
所有哺乳动物细胞都能通过糖酵解和线粒体氧化磷酸化产生不同比例的ATP。这些细胞内过程不仅产生能量，还能为细胞分裂、种系发育以及表观修饰提供重要的代谢中间物。糖酵解和氧化磷酸化OXPHOS之间紧密调节的平衡对于干细胞的自我更新和分化特别重要。有报道称糖酵解的活化以及OXPHOS的抑制能够提高体细胞向诱导型多能干细胞重编程的效率。特别是对于生殖细胞，越来越多的证据表明一个复杂的转录因子、代谢驱动因子以及信号通路中的分子网络协同作用以维持糖酵解和OXPHOS之间生物能量的平衡。例如单细胞RNA-seq发现在精子发生不同阶段代谢驱动因子差异表达。此外，FOXO1能够调节MYC/MYCN 转录因子的表达，反之调节影响SSC自我更新的细胞周期和糖酵解。大多数研究提示成人干细胞坐落在一个低氧张力的生态位，因此依赖糖酵解产生能量以避免OXPHOS产生的ROS造成的DNA损伤。然而，SSCs和未分化的精原细胞坐落在精小管的基部，有一层精母细胞和精子细胞依次从基部向管腔迁移的区域。由于血管在输精管之间，氧气只能通过扩散的方式到达腔内。与减数分裂以及减数分裂后的生殖细胞相比，精原细胞相对更易获得氧气。的确，有报道称ROS是小鼠SSC通过活化P38/MAPK和JNK信号通路实现自我更新所必需的。然而，近期的研究也表明缺氧培养条件下糖酵解的增加有利于SSC的建立以及长期维持。在精原细胞分化过程中糖酵解和OXPHOS之间平衡是否改变以及这一过程是否需要一个高水平的OXPHOS 尚未明确。研究者因此进行试验证实在精原细胞分化中代谢的改变及其调节机制。利用体外分化的平台，研究者发现未分化的精原细胞适应了一个与分化群体不同的能量倾向。此外，研究者确定了一些新的代谢调节因子在未分化的和分化的精原细胞中差异表达。生物能量平衡的破坏将会导致精原细胞生殖和分化受到破坏，由此说明代谢调节在精原细胞命运的特异性中发挥重要作用。为了理解出生后生殖细胞发育过程中代谢的改变，研究者首先建立了一个体外精原细胞培养和分化的平台。未分化的精原细胞呈典型的簇状葡萄样克隆（图1a），并且通过流式分析发现90%的表达细胞表面抗原CD90和CD9（图1b）。在RA诱导的分化中精原细胞克隆集落连接松散（图1a）并且开始分化为c-Kit+细胞（图1b）。此外，未分化的精原细胞高表达SSC标记物，例如应答RA处理后下调的ID4, GFRα1, and PLZF（图1c、d）。相反，在RA诱导c-Kit+分化的细胞中c- Kit, STRA8,以及SYCP3的RNA水平和蛋白水平都升高（图1b-d）。在体外维持精原细胞以及体内发展的CD9+/c-Kit−细胞之间标记基因(Gfrα1, Plzf, Id4, Ngn3)的表达没有统计学显著差异（图1e）。同样c-Kit和Sycp3在体外RA处理的群体以及c-Kit+细胞中的表达水平相当（图1e）。然而，研究者发现与体内相比，体外培养的细胞Gfrα1 和Stra8的表达水平升高（图1e）。一个可能的解释是体内分离的群体与高度的异质性相关。例如，分离的c-Kit+细胞包括不同发育阶段的分化细胞，能够表达不同水平的Stra8。CD9+/c-Kit−细胞包含不同发育阶段未分化的精原细胞并且可能受一些表达CD9的基质细胞污染。体外培养有利于未分化精原细胞的生长并且使它们对RA处理的应答以一个更加同质的方式同步。Stra8表达升高的另一种可能是由于体外高的RA诱导剂量。然而，在Kitw/w-v小鼠的睾丸中能维持超过4个月的未分化的精原细胞在输精管移植后重建精子发生并且形成ACR+以及PNA+的精子细胞（图1f-h），该模型内源生殖细胞发育缺陷。相反，在RA处理组中第四周观察分化的精原细胞，在移植后2个月并未检测到精子细胞（图1f-h），提示RA能够充分诱导分化。总之，研究者成功的建立了一个精原细胞培养的体外分化平台。
图1建立精原细胞培养和体外分化的平台 Establishin
为了确定在精原细胞分化过程中代谢的动态变化，研究者首先在RA诱导下评估了ATP的水平以及ROS的产生。研究者发现ATP的水平在开始是降低的，但是在RA处理第三天显著升高（图2a），提示精原细胞分化过程中能量产生和消耗之间平衡的动态改变。有趣的是，ROS的水平在24h开始升高并且在RA诱导后48h显著升高（图2b），提示在精原细胞分化过程中线粒体OXPHOS的升高。为了进一步确定精原细胞分化过程中不断变化的代谢偏好性，研究者建立了一个包含荧光胞浆SoNar传感器的原生精原细胞系，传感器的轻度反应了胞浆中NAD+和NADH氧化还原的状态。一般而言，糖酵解产生NADH，传递至线粒体后氧化为NAD+或者当在胞浆中由丙酮酸产生乳酸时通过乳酸脱氢酶(LDH)再循环成NAD+。因此胞浆内NAD+/NADH比值是由这三条信号通路网络平衡决定的。研究者发现未分化的精原细胞相对于RA诱导24小时分化的精原细胞具有更高的NAD+/NADH比率（图2c）。当草氨酸处理封闭LDH的活性时，未分化精原细胞中NAD+/NADH的比率显著降低（图2c），提示细胞中从丙酮酸向乳酸转化的活化。相反，分化的精原细胞并不能很好的应答草酸盐抑制（图2c），因为不同发育阶段的生殖细胞可能表达不同的LDH异构体，研究者检测了应答草酸盐抑制时LDH的活性并且证实在两个群组中草酸盐处理能够有效的抑制LDH的活性。与这些发现一致的是，当直接测量时，在未分化精原细胞中LDH的活性显著高于RA处理分化的群体（图2d）。研究者通过在野生小鼠体内发育的CD9+/c-Kit−未分化精原细胞以及c-Kit+分化精原细胞中评估LDH的活性，进一步证实了这些结果（图2e）。此外，研究者近期报道在c-Kit+分化的精原细胞中ROS的水平显著高于那些体内发育的CD90+/c-Kit−未分化的精原细胞。因此这些证据证实在生理条件下精原细胞分化过程中糖酵解降低，OXPHOS升高。尽管间质体细胞例如睾丸中的Leydig细胞也表达c-Kit，这些细胞大部分是在多个精原细胞分离过程中利用连续胰酶和胶原酶从细精管上剥离的。利用实时定量RT-PCR分析分选高表达生殖细胞标记物的c-Kit+细胞。最终，为了排除这些代谢的改变是由于RA处理的直接效应，研究者在同一RA处理的群体中收集了c-Kit−和c- Kit+细胞并且检测了它们LDH的活性。在c-Kit−精原细胞中LDH的活性显著更高，由此证实代谢的转变并不是RA处理的转变，而是由精原细胞发育阶段决定的。总之，这些结果提示精原细胞分化后氧化还原状态发生改变，并且需氧糖酵解在未分化精原细胞中高度活化使丙酮酸向乳酸转化再生NAD+。利用Seahorse细胞外通量分析仪，研究者接下来在未分化精原细胞以及RA诱导24h和48h后分化精原细胞中检测了细胞外酸化速率(ECAR)。原则上，ECAR反应了Krebs循环中糖酵解和质子贡献。研究者发现在RA诱导分化的24h，分化的精原细胞中糖酵解的能力降低，并且在48小时后进一步降低，实验结果由连续加糖、寡霉素（抑制OXPHOS）、2-DG（抑制糖酵解）后ECAR最大变化值计算，提示在未分化精原细胞中糖酵解的活性更高（图2f）。为了进一步区分Krebs循环糖酵解的酸化作用，研究者在葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸存在时顺次添加鱼藤酮/抗霉素A(阻断OXPHOS)以及2-DG检测了未分化精原细胞和RA诱导后细胞的质子外流率(PER)（图2g）。除线粒体衍生的酸化和代偿性糖酵解外这两种基础的糖酵解沿着分化轨迹逐步降低，由此说明在未分化精原细胞中糖酵解的水平更高。此外，研究者分析了代表线粒体呼吸水平的耗氧率(OCR)，并且发现在RA处理48h后分化的精原细胞基础OCR的水平升高（图2h）。线粒体呼吸的最大量通过连续添加寡霉素后OCR以及添加抗霉素A后FCCP的变化测量，并且发现在RA处理24h和48h后显著升高（图2h），提示精原细胞分化中线粒体呼吸上调。总之研究者的数据发现精原细胞分化过程中从糖酵解到线粒体呼吸代谢的转变。
图2 在未分化和分化的精原细胞中不同的能量偏好性
在糖酵解途径抑制葡萄糖-6-磷酸和戊糖的产生抑制精原细胞的分化
为了确定精原细胞分化过程中重要的代谢通路，研究者在糖酵解的不同步骤利用抑制剂处理了细胞（图3a）。与上述分化精原细胞更倾向于OXPHOS产生能量一致，enoblock能抑制从2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇丙酮酸的形成，但对精原细胞分化没有影响，在RA诱导的c-Kit+细胞中与对照组中的比例相似（图3a、b）。同样，抑制丙酮酸向乳酸转化的草酸酯在60 mM或者更低的浓度下对精原细胞分化没有明显的影响。在120mM的高浓度下，草酸脂引起明显的细胞死亡，这可能是细胞毒性的结果。有趣的是，2-DG是一种糖原类似物，能够抑制糖酵解的起始步骤从葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸(G6P)，在处理24小时内显著封闭精原细胞分化（图3a、d）。在2-DG处理细胞中RA诱导后c-Kit+细胞的比例降低至23.8%，而对照组为93.6%（图3a、d）。能够催化葡萄糖到G6P的己糖激酶的另一种抑制剂氯尼达明处理后，能够导致相似的结果（图3a、e），证实G6P的形成在精原细胞分化中非常重要。由于G6P能够通过磷酸戊糖途径（PPP）合成核苷酸，研究者猜想精原细胞分化降低可能是由于代谢供应减少，例如用于核苷酸合成的5-磷酸核糖。研究者利用在PPP第一步能够催化G6P生成6-磷酸葡萄糖酸内酯的G6P脱氢酶的抑制剂6-氨基烟酰胺对该假说进行了检测（图3a）。的确，6-氨基烟酰胺能够显著封闭精原细胞的分化，导致c-Kit+细胞从93.6%降低到27.9%（图3f）。总之研究者的数据提示在糖酵解和PPP中活化G6P的形成是精原细胞分化所必需的。利用相同浓度的抑制剂，研究者进一步检测了精原细胞维持中的影响。CD90+/c-Kit−未分化精原细胞的比例并未发现明显的改变（图3b、d、f）。在氯尼达明处理24h后克隆形成的大小轻微降低。随着SSC群体每隔5-6天数量翻倍，短期糖酵解的抑制并不能检测到精原细胞维持的缺陷。然而，氯尼达明处理后能够显著降低SSC标记物Gfrα1和Id4的表达水平。在早期分化的精原细胞中主要表达的基因Ngn3在2-DG、6-氨基烟酰胺或者enoblock处理后升高（图3g）。研究者进一步发现延长2-DG处理2-3天将会导致精原细胞克隆大小和细胞数量的显著降低（图3h），提示糖酵解的抑制也能损害精原细胞的自我更新。
图3在糖酵解中从葡萄糖到G6P的形成是精原细胞分化所必需的
抑制OXPHOS能够封闭精原细胞分化
利用相同的策略研究者通过不用抑制剂靶向线粒体呼吸链确定在精原细胞分化过程中需要OXPHOS中特异的酶复合体。这些抑制剂包括鱼藤酮对抗复合物I、抗霉素A抑制络合物III、抑制ATP合成功能的寡霉素以及通过破坏线粒体膜破坏ATP合成的FCCP（图4a）。所有这些抑制剂能够在RA诱导24h内显著阻止c-Kit+细胞的形成（图4b-d），说明在精原细胞分化中非常需要OXPHOS。相同的抑制剂处理并不改变CD90+/c-Kit−未分化精原细胞的比例（图4b-d）并且精原细胞的形态在24小时处理后是正常的。研究者进一步通过实时荧光定量RT-PCR检测了SSC标记基因的表达。研究者发现鱼藤酮处理并没有效果，但是抗霉素A、FCCP以及寡霉素都能使Gfrα1的表达水平降低（图4e）。此外，鱼藤酮或者寡霉素延长处理2-3天能够显著降低精原细胞数量和克隆的大小（图4f），提示线粒体呼吸是精原细胞长时间维持增殖所需要的。
图4 精原细胞分化需要OXPHOS
精原细胞分化过程中代谢调节因子差异表达
为了系统的探究在精原细胞分化过程中代谢改变的分子机制，研究者对未分化精原细胞以及36小时RA诱导后的细胞进行了RNA-seq分析以评估其全基因组表达图谱。研究者证实SSC的标记基因，例如Gfrα1, Id4, Plzf, Etv5, 以及Sall4在未分化精原细胞中高表达（图5a）。相反，提示精原细胞分化的基因，例如Sycp3, Stra8, 以及c-Kit在RA诱导后显著升高（图5a）。有趣的是，这两个细胞群在一些代谢酶的水平上也表现出变化的差异，包括糖酵解中的如HKs,Aldoa, Eno1/2, 以及Ldha/b（图5a）。更重要的是，一些已知的代谢调节因子如Pdk1/2, Srf, c-Myc, 以及Mycn在RA诱导群体的未分化的精原细胞中表达水平不同（图5a）。与这些结果一致的是，利用KEGG数据库进行GO分析发现在未分化的和分化的精原细胞中糖酵解在差异调节信号通路中居首。研究者进一步通过独立实验中所有RNAs的实时荧光定量RT-PCR验证了这些RNA-seq的结果。在糖酵解中一些酶的水平在精原细胞分化的不同阶段的确下调（图5b）。例如， 催化丙酮酸到乳酸转变的酶Ldha和Ldhb的表达水平在RA处理24小时后降低（图5b），与研究者观察到的产生能量的需氧糖酵解在未分化的精原细胞中高度活化，尽管在RA处理48h的分化精原细胞中Ldha和Ldhb的转录水平与未分化的精原细胞具可比性（图5b），LDH的活性测量实验以及Seahorse对ECAR的分析提示它们的蛋白水平和活性似乎仍然维持在很低的水平（图2），提示LDH酶活性的转录后调节。显著的是，研究者发现己糖激酶异构体的差异表达。异构体Hk2在整个分化过程中下调（图5c）；另一方面Hk3的表达在24h RA诱导后没有改变但是在48h RA诱导后显著上调（图5c），提示在精原细胞分化过程中阶段特异异构酶的差异调节机制。有趣的是，FOX家族中的一些成员在RA诱导分化中的一些未分化精原细胞中差异表达（图5a、d）。为了验证在体内精原细胞分化过程中这些酶和调节因子是否具有相似的表达图谱，研究者对小鼠睾丸中分选得到的CD9+/c-Kit−未分化的以及c-Kit+分化的精原细胞进行了实时荧光RT-PCR，的确，研究者发现在CD9+/c- Kit−未分化的精原细胞中糖酵解的酶高表达，而在c-Kit+细胞中线粒体调节因子高表达（图5e）。此外，一些代谢调节因子（如Fox基因和Mycn）在体内精原细胞发育过程中与体外发现的具有相似的表达图谱（图5e）。因为代谢调节因子和酶也可能受蛋白质翻译、翻译后修饰或者酶异构体差异表达的调节，转录的水平可能反应未分化和分化精原细胞间这些基因的一些而不是所有改变。为了理解精原细胞分化过程中基因表达在蛋白水平的变化，研究者进一步对未分化精原细胞和RA诱导分化群体的蛋白组学进行定量。共计定量了4879个蛋白并且在这两个群体中502个蛋白差异表达。与RNA-seq分析结果一致的是，在糖酵解中一些重要的酶，例如HK2,ALDOA, PGK1, PKM, 以及LDHA在分化的精原细胞中显著降低（图5f）。通过磷酸化丙酮酸脱氢酶抑制柠檬酸循环的激酶PDK1也是下调的（图5f）。重要的是，GO富集分析说明在未分化的和分化的精原细胞中所有差异调节的细胞过程中参与代谢过程的蛋白位居首位（图5g）。总之，研究者的结果提示在未分化的和分化的精原细胞中代谢调节因子在转录和蛋白水平的差异表达图谱，并且这些似乎在精原细胞分化过程中驱动从糖酵解到线粒体呼吸的代谢转换。
图5 精原细胞分化过程中代谢调节因子的差异表达
在本研究中研究者发现精原细胞中ATP的产生在视黄酸(RA)诱导分化后逐渐升高。为了适应能源需求的增加，RA信号同时将精原体内ATP的产生从糖酵解转变为线粒体呼吸，伴随着活性氧含量的增加。破坏线粒体呼吸显著阻断了精原细胞分化。抑制葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸或磷酸戊糖信号通路也抑制了c-Kit+分化生殖细胞的形成。糖酵解的代谢产物是精原细胞分化所必需的。研究者进一步通过RNA-seq和蛋白组学定量分析证实一些代谢调节因子和酶的表达水平在RA诱导分化后显著改变。总之研究者的结果证实在糖酵解和线粒体呼吸之间严格调控的生物能量平衡是精原细胞增殖和分化所必需的。
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