科研| EcoEnv：比较转录组学揭示两种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）对斑马鱼幼体线粒体和神经发育损害的机制
编译：秦时明月，编辑：景行、江舜尧。
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医药和化妆品残留是新出现的污染物，已经在世界各地的环境中越来越多地被检测到。某些类别的药物(如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs))的广泛使用以及这些化合物在低剂量下具有生物效应会产生广泛的环境问题。预测SSRIs在非靶生物中的毒性效应的一个难点是其作用机制还没有被完全了解。为了更好地了解SSRIs的潜在毒性效应，研究人员采用RNA-seq的方法来发掘早期处理于两种SSRIs(氟西汀和帕罗西汀)的潜在途径。将野生型斑马鱼(Danio Rerio)胚胎100μg/L的氟西汀或帕罗西汀处理6天后，提取单个幼鱼脑中的RNA并测序。差异基因表达分析确定了1550个显著受SSRI处理影响的基因，其中138个基因的核心集合被两个SSRI改变。加权基因共表达网络分析确定了7个基因模块，它们的表达模式与SSRI处理显著相关。差异表达基因和网络模块基因的功能富集分析都识别到了与线粒体和神经元结构、线粒体呼吸和神经发育过程相关的各种分类。这些分类的富集表明，SSRI的毒性效应可能是由线粒体功能障碍和随后的神经发育效应引起的。本研究是第一次对SSRI在斑马鱼发育过程中的组织特异性转录效应的研究，提供了关于SSRI处理的亚致死效应的特定的、高分辨率的分子数据。
论文ID
原名：Comparative transcriptomics implicate mitochondrial and neuro developmental impairments in larval zebrafish (Danio rerio) exposed to two selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs)
译名：比较转录组学揭示两种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）对斑马鱼幼体线粒体和神经发育损害的机制
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872
发表时间：2020年7月
通讯作者：Anne E. McElroy
通讯作者单位：纽约州立石溪大学
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2020.110934
实验设计
结果
总体而言，研究人员分析了超过27,000个基因在单个斑马鱼幼体大脑中的表达。差异表达分析发现，1518个基因与帕罗西汀处理的对照组大脑有显著差异。在这些差异表达基因中，58%显著下调，1518个基因中有885个与对照组相比表达降低，633个基因在帕罗西汀处理后显著上调。差异表达分析确定了氟西汀处理组与对照组有显著差异的170个基因。与帕罗西汀相似，氟西汀处理后的转录本中有60%下调，其中102个基因表达下调，68个基因表达上调。在两个SSRI处理之间，有1550个差异表达的独特基因，其中包括138个氟西汀和帕罗西汀处理的共同基因。无论幼鱼接触的是哪种药物，所有138个共同基因在表达变化的方向上都是一致的(图1)。
2 利用RT-qPCR验证RNA-Seq结果
从RNA-Seq数据中选择的所有6个基因的TPM值相对于对照样本都显示显著的增加，倍数变化从1.5到2.7不等，这与测序数据中观察到的结果密切相关，并验证了研究人员的测序结果(图2)。RT-qPCR分析证实，帕罗西汀处理后，除KLF9基因外，其余基因的表达均显著上调(p<0.001)，尽管没有显著性差异，但仍呈高度上调的模式(增加2.46倍)。相反，RT-qPCR没有成功地检测到氟西汀处理后显著的表达变化，尽管所有选定的基因都有一致的上调趋势，倍数变化在1.64到3.44之间。
3 加权基因共表达网络分析(WGCNA)
WGCNA分析产生了一个包含19个基因模块的网络(图3)，每个模块的大小从51到7133个基因不等(表1)。7个模块与SSRI处理显著相关(表1)。模数5、6、11、14和15与氟西汀和帕罗西汀的处理均显著相关，模数17仅与氟西汀处理显著相关，模数12仅与帕罗西汀处理显著相关。模块5和15总共包含96%以上与SSRI处理显著相关的模块基因。
图3.网络分析生成的基因共表达网络。
表1. WGCNA模块大小及不同模块基因表达模式的皮尔逊相关系数。
4 差异表达基因和WGCNA模块基因的功能图谱
差异表达基因的功能富集分析显示64个GO项显著富集(图4)。差异表达基因只有3个分子功能被富集：Neuresin家族蛋白结合、对RNA的催化活性和转录共调节活性。丰富的生物学过程包括相对宽泛的分类，如RNA加工、蛋白质折叠和各种特定代谢过程，在这些组中丰富的细胞成分分类中的很大一部分涉及到线粒体，例如，线粒体基质、线粒体蛋白复合体、线粒体核糖体或线粒体膜蛋白复合体。
除了GO富集分析，功能富集分析确定了与差异表达基因(表2)相关的16个不同的途径，包括一条KEGG途径(脂肪酸延长)和多条反应组途径，其中大多数涉及线粒体或电子传输过程。HPO富集发现了与该基因列表相关的多种人类疾病表型，包括神经发育延迟和异常以及肌肉生理学。
研究人员还对与SSRI处理显著相关的七个模块进行了功能富集分析。模块5和15是唯一显著富集了GO分类以及各种KEGG、Reactome和HPO分类的模块。尽管模块11包含的基因较少，但它有几个KEGG和Reactome分类得到了显著富集(表2)。所有剩余的模块都没有任何明显富集的GO或通路分类。在保留的三个模块之间，功能富集分析产生了399个GO分类的组合(图5)，以及在三个模块之间显著丰富的9个KEGG通路、48个反应组通路和130个HPO分类(表2)。
模块5在总共204个分类中得到了显着的富集(图5A)。丰富的分子功能分类包括各种酶活性，如ATP合成、RNA代谢(如RNA结合和转录辅助调节活性)和神经相关功能，如神经肽激素活性。许多丰富的生物学过程分类涉及RNA加工(例如mRNA加工、RNA剪接和基因表达)、线粒体和能量产生(例如线粒体组织、线粒体ATP合成耦合电子传递和线粒体蛋白定位)以及神经生物学(例如神经发生、突触传递调节和神经元分化)。同样，还有一些细胞成分分类与RNA代谢相关(例如核糖体成分、核糖核蛋白复合体和RNA聚合酶复合体)、线粒体(例如线粒体基质、线粒体呼吸链复合体I或ATP合成酶复合体)和神经元(例如突触和神经投射)。
模块15在202个GO分类中显著富集，并与模块5共享许多类似的富集分类(特别是神经发育过程)，但没有显著富集线粒体或能量代谢分类(图5B)。显著富集的分子功能分类包括核酸结合、转录辅助调节/辅助抑制活性和组蛋白去甲基酶活性等。富集的生物学过程包括许多神经发育分类(如神经发生、轴突引导和神经元投射发育)，但也包括与一般胚胎发育有关的分类，如Wnt信号、胚眼发育和解剖结构发育。同样，富集的细胞成分包括各种不同的神经成分，如轴突或突触膜，以及核结构，如染色质、染色体和细胞核。
表2.从感兴趣的基因集的功能分析中选出的结果，包括差异表达基因列表和WGCNA模块。
结论
在这项研究中，研究人员利用RNA测序毒理基因组学方法，评估了亚致死性SSRIs处理的行为效应的分子决定因素。用氟西汀和帕罗西汀处理斑马鱼胚胎，其可以在视觉运动反应期间持续改变斑马鱼幼鱼的游泳行为。使用SMART-SEQ v.4技术对个体大脑进行解剖和测序。除了通过差异基因表达分析确定转录组范围的变化外，研究人员还使用WGCNA来确定与SSRI处理显著相关的基因模块。功能分析确定了与线粒体功能和神经发育相关的多个分类，这意味着SSRI对发育中的鱼类的毒性涉及线粒体介导的神经发育异常。
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