科研 |CELL DEATH DIS：刺甘草查尔酮诱导AKT/mTOR依赖的自噬和凋亡而抑制食管癌肿瘤的生长和侵袭（国人佳作）
编译：阿温，编辑：景行、江舜尧。
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食管鳞状细胞癌(ESCC)是最常见的恶性肿瘤之一，生存率较低。因此，临床治疗迫切需要寻找稳定、安全、高效的新药物。本研究旨在从一个包含429种天然产物的化合物文库中识别出潜在的抗癌药物。从甘草中分离得到的刺甘草查尔酮对ESCC具有明显的细胞凋亡、抑制增殖和转移的能力。共聚焦荧光显微镜数据显示，刺甘草查尔酮显著诱导ESCC细胞自噬，自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1减弱了刺甘草查尔酮对细胞活力和凋亡的抑制作用。机制上，RNA测序结合生物信息学和一系列功能分析显示，刺甘草查尔酮通过失活AKT/mTOR信号通路而诱导细胞凋亡和自噬，然而AKT的结构性激活则显著抑制了这一作用。此外，研究证明了刺甘草查尔酮在异种移植瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用，并以剂量依赖的方式显著抑制ESCC细胞的迁移和侵袭能力。本研究的发现首次证明刺甘草查尔酮可能是治疗ESCC的一个新的治疗策略。
论文ID
原名：Echinatin suppresses esophageal cancer tumor growth and invasion through inducing AKT/mTORdependent autophagy and apoptosis
译名：刺甘草查尔酮诱导AKT/mTOR依赖的自噬和凋亡抑制食管癌肿瘤的生长和侵袭
期刊：Cell Death & Disease
IF：6.304
发表时间：2020年7月
通讯作者：许文文
通讯作者单位：暨南大学生命科学技术学院
DOI号：10.1038/s41419-020-2730-7
实验设计
结果
本研究之前已从含429种化合物的天然药物库中鉴定出有效的抗癌药物。本研究中，从甘草属植物(豆科)的根和根茎中提取的甘草活性成分刺甘草查尔酮(图1a)，被鉴定为ESCC细胞增殖的候选抑制剂。为了评价刺甘草查尔酮对ESCC细胞增殖的影响，本研究用浓度递增的刺甘草查尔酮处理KYSE30和KYSE270细胞，持续5天。如图1b所示，刺甘草查尔酮以剂量和时间依赖的方式显著抑制细胞增殖。克隆形成实验表明，刺甘草查尔酮显著降低了克隆形成的能力(图1c)。综上所述，刺甘草查尔酮在ESCC中可能具有抑癌活性。为观察刺甘草查尔酮对ESCC细胞凋亡的影响，用之前浓度的刺甘草查尔酮处理ESCC细胞，结果显示，刺甘草查尔酮以剂量依赖性的方式诱导ESCC细胞凋亡(图1d和S1A)，表明刺甘草查尔酮可诱导ESCC细胞凋亡。经刺甘草查尔酮处理后，凋亡标志物表达增加，包括cleaved-caspase-3和cleaved-PARP(图1e和S1B)，进一步证实刺甘草查尔酮对细胞凋亡的诱导作用。总之，这些结果表明刺甘草查尔酮可触发ESCC细胞凋亡，抑制细胞增殖。
图1. 刺甘草查尔酮抑制ESCC细胞增殖。a刺甘草查尔酮的化学结构。b用不同浓度的刺甘草查尔酮处理KYSE30和KYSE270细胞(浓度不超过40 μM)，CCK-8法测定细胞活力。c暴露于刺甘草查尔酮后，KYSE30和KYSE270细胞的克隆形成受到抑制。d不同浓度刺甘草查尔酮作用48 h后，Annexin V-FITC/PI双染色法检测ESCC细胞凋亡。Western blot检测刺甘草查尔酮处理48 h后ESCC细胞中cleaved caspase-3、caspase-3和cleaved PARP的表达情况。
2 刺甘草查尔酮诱导ESCC细胞自噬
接下来研究人员研究了刺甘草查尔酮是否能诱导ESCC细胞自噬。共聚焦分析显示，将KYSE30和KYSE270细胞暴露于刺甘草查尔酮中可导致LC3点状细胞积累(图2a, b)。此外，western blot结果证实刺甘草查尔酮处理的细胞中LC3的表达呈剂量依赖性增加(图2c)。此外，如图2d, e所示，自噬抑制剂bafilomycinA1 (BafA1)预处理可以恢复刺甘草查尔酮处理的KYSE30和KYSE270的细胞活力和克隆形成能力。在BafA1处理下，刺甘草查尔酮诱导的细胞凋亡被逆转(图2f)，而在BafA1阻断自噬后，刺甘草查尔酮诱导的cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达也显著下降(图2g)。说明刺甘草查尔酮诱导ESCC细胞凋亡可能是通过激活自噬来实现的。
3 AKT/mTOR信号通路介导刺甘草查尔酮对ESCC细胞自噬和凋亡的作用
为探讨刺甘草查尔酮诱导ESCC细胞凋亡和自噬的分子机制，采用RNA-seq分析20 μM刺甘草查尔酮处理48小时后KYSE30细胞中差异表达的基因。共鉴定出688个基因被刺甘草查尔酮显著调控(fold change≥4)，包括上调105个，下调583个(补充表S1)。然后使用IPA分析描述典型通路。图3a所示，刺甘草查尔酮调控的一簇基因构成了一个强烈指向AKT通路的信号网络。经验证，研究人员发现刺甘草查尔酮可以显著降低p-AKT和p-mTOR的表达水平(图3b)，这表明刺甘草查尔酮可以抑制mTOR/AKT通路，而mTOR/AKT通路在不同类型的癌症中可以抑制自噬。为了研究刺甘草查尔酮是否通过AKT/mTOR途径诱导细胞自噬和凋亡，研究人员将AKT的组成活性形式AKT (T308D/S473D)的载体转染到KYSE30和KYSE270细胞中，检测刺甘草查尔酮的抗癌作用(图3c)。结果显示AKT (T308D/S473D)的表达显著提高了经刺甘草查尔酮处理的KYSE30和KYSE270细胞的活力(图3d)。此外，AKT (T308D/S473D)过表达抑制了刺甘草查尔酮诱导的细胞凋亡(图3e)， western blot进一步证实，AKT (T308D/S473D)过表达时，刺甘草查尔酮诱导的cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达明显减少(图3f)。此外，AKT (T308D/S473D)过表达也能逆转刺甘草查尔酮处理后LC3蛋白表达升高的趋势(图3f)。本研究结果表明，刺甘草查尔酮通过抑制AKT/mTOR通路诱导ESCC细胞自噬性凋亡。
图3. AKT/mTOR信号通路介导刺甘草查尔酮对ESCC细胞自噬和凋亡的作用。a IPA通路分析提示刺甘草查尔酮处理的KYSE30细胞中AKT通路失调。b将KYSE30和KYSE270细胞暴露于不同浓度的刺甘草查尔酮作用48 h，采用western blot检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的表达水平。c-f KYSE30和KYSE270细胞转染AKT(T308D/S473D)表达质粒或空载，不同浓度刺甘草查尔酮处理48 h,然后相比p-mTOR表达(c),细胞生存能力(d),细胞凋亡(e)和AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, LC3, cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达水平(f)。
4 刺甘草查尔酮增强ESCC细胞对5-FU的敏感性
ESCC的不良预后与化疗耐药有关。为了研究刺甘草查尔酮在肿瘤化疗耐药性中的生物学作用，研究通过CCK-8、克隆形成和western blot检测了有无刺甘草查尔酮的ESCC细胞对5-FU的敏感性。与低剂量刺甘草查尔酮或5-FU单独使用相比，低剂量刺甘草查尔酮和低剂量5-FU联合显著抑制细胞生长(图4a)和集落形成(图4b)。刺抑素和5-FU联合处理ESCC细胞后，cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表达增加(图4c)。总的来说，这些数据表明刺甘草查尔酮可以通过诱导ESCC细胞凋亡而增加细胞对5-FU的敏感性。
图4. 刺甘草查尔酮增强ESCC细胞对5-FU的敏感性。a, b采用CCK-8法(a)和克隆形成试验(b)检测KYSE30和KYSE270细胞在5-FU(1.25或0.3 μM)、刺甘草查尔酮(20 μM)单独作用或5-FU与刺甘草查尔酮联合作用5 d后的细胞活力和克隆形成能力。c 刺甘草查尔酮增加了5-Fu处理的ESCC细胞的凋亡，这表明cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达水平升高。
5 刺甘草查尔酮抑制ESCC细胞的迁移和侵袭
接下来研究人员分析了刺甘草查尔酮对ESCC细胞迁移和侵袭特性的影响，结果显示，刺甘草查尔酮显著抑制了KYSE30和KYSE270细胞的迁移和侵袭能力(图5a, b)。western blot检测EMT标志物vimentin、β-catenin和E-cadherin的表达。E-cadherin表达升高，vimentin和β-catenin表达降低，表明刺甘草查尔酮通过逆转EMT抑制ESCC细胞的迁移和侵袭。为了研究刺甘草查尔酮是否通过AKT途径抑制迁移和侵袭，将AKT (T308D/S473D)质粒转染KYSE30和KYSE270细胞，结果表明，AKT信号通路的激活可明显消除刺甘草查尔酮对ESCC细胞迁移和侵袭的抑制作用(图5d, e)。
图5. 刺甘草查尔酮抑制ESCC细胞的迁移和侵袭。通过细胞迁移和侵袭实验测定不同浓度刺甘草查尔酮作用KYSE30和KYSE270细胞24 h后的迁移能力(a)和侵袭能力(b)。c Western blot分析刺甘草查尔酮作用于KYSE30和KYSE270细胞24 h后vimentin、β-catenin和E-cadherin的表达，将转染AKT (T308D/S473D)表达质粒或载体对照的KYSE30和KYSE270细胞以指定浓度的刺甘草查尔酮处理24 h，比较其迁移能力(d)、侵袭能力(e)。
6 刺甘草查尔酮抑制裸鼠ESCC肿瘤异种移植瘤的生长
分别用20 mg/kg和50 mg/kg的刺甘草查尔酮口服KYSE270来源的肿瘤异种移植瘤裸鼠，观察其对肿瘤生长的影响。结果发现，接受20 mg/kg和50 mg/kg刺甘草查尔酮治疗组的肿瘤负荷分别显著抑制57%和48%(图6a)。Western blot数据显示，刺甘草查尔酮抑制AKT/mTOR通路，表现为p-AKT和p-mTOR表达水平降低(图6b)。在体重方面，治疗组和对照组之间没有显著差异(图6c)。此外，刺甘草查尔酮治疗对肺、肝、肾等重要器官的形态没有明显改变(图6d)。此外，裸鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平无显著差异(图6e)，表明刺甘草查尔酮对动物无毒性作用。
图6. 刺甘草查尔酮抑制裸鼠ESCC肿瘤异种移植瘤的生长。采用口服刺甘草查尔酮(20mg/kg或50mg/kg)治疗KYSE270来源异种肿瘤裸鼠，每2天给药一次(n=6/组)，对照组只给生理盐水。a肿瘤曲线显示刺甘草查尔酮能明显抑制异种肿瘤的生长。b Western blot检测刺甘草查尔酮或空白处理小鼠肿瘤组织中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR和LC3的表达水平。c实验期间裸鼠体重。d苏木精和伊红(H&E)染色治疗组和对照组小鼠肺、肝、肾标本。e刺甘草查尔酮治疗组与对照组血清ALT、AST水平比较。
结论
综上所述，刺甘草查尔酮是一种潜在的抗癌天然产物，对ESCC的肿瘤发生和转移具有抑制作用，并能使ESCC细胞对5-FU治疗敏感。从机制上讲，刺甘草查尔酮通过AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬和凋亡(图7)。这是首次证实刺甘草查尔酮的抗癌生物活性及其机制。这些研究结果为刺甘草查尔酮作为ESCC治疗的潜在选择提供了坚实的证据。
图7. 刺甘草查尔酮在癌细胞中的作用机制示意图。激活AKT/mTOR信号通路抑制自噬，调节ESCC细胞增殖与凋亡之间的平衡，而刺甘草查尔酮通过抑制AKT/mTOR通路诱导细胞自噬与凋亡，抑制细胞生长与肿瘤发生。
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