近期有些朋友提出希望我能够出一个面向非专业人士科普版的氢气机理，这个建议很好，我会在《氢气生物学机理》这个专题结束后写一篇。开始写“氢璞”的时候计划先写几个专题，每个专题相当于书的一章，每周写一篇三千到五千字，一年有52周，大概能写15万字左右，差不多可以作为一本教材开一门选修课程了。所以“氢璞”更多是考虑知识的逻辑和系统性，其中穿插部分科学思想是如何慢慢由浑沌向清晰转变的内容，强调质疑的科学思维，这也是未来“年氢人”最宝贵的。我们身处氢生物学蹒跚起步这样一个重要科学事件的中心，能够作为一个参与者是一种幸运，我希望这样细水长流地写可以在繁忙之余系统有目标地做一件事情，但还是经常忙起来完成的不好。上一篇介绍了在绿豆种子萌发过程中包括根、下胚轴（豆芽白色的部分）在内的不含叶绿体的组织都可以产生氢气，表明氢气的来源可能是除叶绿体外的其他结构。
三、线粒体可以产生氢气
由于下胚轴量相对多些容易操作被用作寻找氢气“主人”的实验材料，实验采取的是最简单的研究思路：分步提取追踪法。由于培养96 小时的绿豆幼苗产氢活性最高，故选择此时绿豆幼苗的下胚轴匀浆打碎后通过差速离心获得不同组分，看看氢气到底藏在哪里。
图1.下胚轴不同组分产氢的比较。A.下胚轴（hypoxotyl）均浆破碎后不同离心力差速离心；B.测定不同组分的产氢量。（Zhang X.,2020）
整个提取过程在4℃低温条件下进行，以免生物活性物质失活。下胚轴的匀浆液经4层无菌纱布过滤1500 g离心 20 min，弃沉淀，沉淀中主要包含组织碎片、核、完整的细胞、其他较重的细胞成分等；上清液经4℃12000 g离心20 min，分别收集上清和沉淀，沉淀使用1mL悬浮缓冲液重悬；12000 g的上清80000 g离心30 min，分别收集上清液及沉淀，沉淀使用1mL悬浮缓冲液重悬。
12000 g沉淀主要为线粒体等细胞器，表现出很强的产氢能力。上清中的产氢活性经80000 g高速离心后消失，说明其中的产氢组分为膜碎片、细胞器碎片或微粒体等比较小的细胞成分。强产生氢气活性主要出现在12000 g和80000 g离心的沉淀中，表明氢气的产生不是在细胞的可溶性溶液成分中，而是在以膜包裹成分（如线粒体、细胞膜碎片等）为主的组分中。我们决定先研究线粒体是否有产氢能力。对12000 g沉淀进一步纯化得到粗提的线粒体，分析表明提取物的线粒体功能保持良好，电子传递与氧化磷酸化偶联程度较好（图2）。
图2. 线粒体体呼吸状态测定。图中标注数字为每段呼吸的斜率这个研究有个小插曲。开始研究时发现，下胚轴打碎了能大量产氢，12000 g离心后总产氢量损失很多，其中沉淀不产氢，上清虽然可以产生氢气，但产氢量降低很多。当把这个上清80000g高速离心后上清和沉淀都不产氢了。这件事情纠结了很久从各种角度找氢气丢失的原因，后来分析应该是沉淀这步把产氢的活性丢掉了，可能是缓冲液出了问题。将重悬沉淀的缓冲液成分逐一验证，发现是金属离子螯合剂EDTA捣的乱（图3 D），当重悬溶液中去掉EDTA后沉淀中产氢量一下子就上去了。这些小的进展足以让学生们开心好久。这个结果也说明产氢应该是需要金属离子的参与，如果和酶有关的话应该是金属酶。
图3.粗提线粒体产氢能力测定。（Zhang X.,2020）
进一步的研究对反应条件进行了优化，发现最适产氢 pH 在 6 左右，温度在 35 度左右（图3 E，F），这代表了生理条件，进一步提示产氢的组分可能是蛋白质（酶）而不是化学成分。除了绿豆外，拟南芥、大豆的线粒体也显示出可以产生氢气（图3 G）。与整株幼苗类似，线粒体产氢也是受到氧气浓度的影响，低氧有利于氢气的产生，且在35℃最适条件下（图3 J）要高于25℃（图3 H, I）。产氢并非马上开始，而是会延迟几个小时，35℃最适条件下（图3 J）延迟时间比25℃要短很多，说明体系需要为产氢做些物质上的准备工作。到底什么条件下才会产生氢气呢？为了打开黑箱我们对反应体系进行了代谢组分析，测定了25℃排氧和常氧条件下开始产氢的起始阶段（6h）和产氢一段时间（10h）后体系的组分。结果让我们惊讶，线粒体能量代谢关联的三羧酸循环（TCA）的中间代谢物琥珀酸、α-酮戊二酸等组分的变化达到了几十倍。这进一步确认了线粒体代谢在产氢中的重要地位，也说明走线粒体这条路没有错。图4. 绿豆下胚轴在25℃条件下产氢的代谢组分析。（Zhang X.,2020）
由于上述研究采用的是粗提线粒体，也就是线粒体不纯还有其它成分，只能是提示可能是线粒体并不能确定一定是线粒体产生了氢气。
线粒体上传递电子的蛋白组成电子传递链，分别叫复合物I 到V，本质上它们都是酶催化氧化还原反应，也就是电子在不同组分间的转移。线粒体电子传递链的抑制剂是研究线粒体功能的重要工具，可以进一步明确产氢是否和线粒体有关并协助寻找功能位点。为了进一步确认线粒体与氢气产生的关系。分别向反应体系中加入不同的线粒体呼吸抑制剂，检测其对线粒体产氢活性的影响，每种抑制剂的作用位点如图 5A 所示。
图5. 线粒体产氢位点分析。A, 线粒体电子传递链示意图及其抑制剂。B, 不同抑制剂对线粒体产氢的影响。C, 产氢过程pH的变化. D, 辅酶Q对产氢的影响。Mixed acid: 5mM pyruvate+5mM malate+5mM α-ketoglutarate+10mM succinate+5mM fumarate. ns, no-significant, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, ****P＜0.0001.（Zhang X.,2020）线粒体复合物 I（CI）的抑制剂鱼藤酮（Rotenone）、复合物IV（CIV）的抑制剂NaN3、解耦联剂FCCP几乎完全抑制了线粒体产氢能力（图5 B），复合物II（CII）抑制剂丙二酸抑制约18%的产氢活性，复合物III（CIII）的抑制剂抗霉素A的产氢抑制率为42%，而加入ATP合酶（CV）抑制剂Oligomycin则促进了线粒体产氢。
复合物 I 和 IV 都可以向线粒体外泵出质子（H+）形成线粒体膜两侧的质子梯度差，FCCP则是可以消除质子梯度，结果表明阻止质子泵出或破坏内膜两侧质子电化学梯度都会抑制氢气的产生。Oligomycin可以阻止质子通过复合物 V 回流,维持线粒体膜两侧较高的质子梯度，加入Oligomycin可以促进氢气的产生。
为了进一步验证线粒体产氢需质子在内膜外侧积累的推测，将线粒体放置不同时间后，测定反应体系中的 pH 变化。结果如图 5C 所示，随着线粒体孵育时间的延长，反应体系 pH 逐渐降低，表明线粒体的产氢过程与膜外质子浓度增加相关联。推测氢气产生可能需要内膜两侧质子梯度的形成，一定的质子梯度是产氢的条件。
以上结果基本确认了氢气是由线粒体产生的，表明线粒体的产氢能力和质子、电子传递过程紧密相关。辅酶Q被作为一种线粒体营养剂曾经被神化，其实它就是线粒体呼吸链的一种电子载体，在复合物CI→CIII 和CII→CIII之间搬运电子。我们就考虑如果外加辅酶Q，电子转移能力增强产氢应该增加。但结果出乎意料（图5 D），当向体系加入辅酶Q却是抑制了氢气的产生。这又是为什么？带着下边的几个问题，下一篇将详细解析线粒体是怎样产生氢气的。Zhang X, Zhang Zh, Wei Y, et al. Mitochondria in higher plants possess H2 evolving activity which is closely related to complex I [J/OL]. arXiv:2001.02132 [q-bio.BM], [2020-01-08]. https://arxiv.org/abs/2001.02132 线粒体产氢
