缺氧诱导的 PLOD1 过表达通过 NF-κB 信号促进胶质母细胞瘤的恶性表型
Oncogene.
IF: 9.867
08 January 2021
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性脑恶性肿瘤，预后最差。其平均生存时间不到 15 个月 。GBM 在 WHO 分类标准中被诊断为 IV 级。GBM基于不同的基因表达被分为四种分子亚型（前神经亚型、神经亚型、经典亚型以及间充质亚型），在这四种分子亚型中，间充质GBM患者的中位生存期最短，且对放化疗的反应最差。此外，研究发现，在治疗过程中低级别胶质瘤和GBM的自然病程中常伴MES转变，这种转变促进肿瘤的增殖，侵入和治疗耐受性。
具有干细胞样特性的细胞亚群，称为胶质瘤起始细胞或胶质瘤干细胞 (GSC)，存在于 GBM 中，在多向分化和自我更新中发挥潜在作用，可导致肿瘤发生、转移、复发，以及放化疗耐药。因此，鉴定与间充质 GBM 中 GSC 的生长、侵袭和 MES 转换相关的基因对神经胶质瘤的临床治疗和基础研究具有重要意义。
前胶原赖氨酰羟化酶 1 (PLOD1) 在食管鳞癌、胃癌和结直肠癌等恶性肿瘤中高表达。生物信息学分析表明，PLOD1 与 GBM 的进展有关，尤其是恶性程度最高的间充质亚型 (MES)。因此，本研究旨在探究在体外和体内PLOD1对间充质GBM发育的影响及其可能的机制。
PCR 检测 mRNA 标记物（EGFR、FN1、YKL40、NEFL、PDGFRA 和 OLIG2）的表达
蛋白质印迹、细胞活力测定、TUNEL 测定......
基因集富集分析（GSEA) 用于检测任何可能的信号通路基因组
卡方检验和t检验用于评估组间的统计显着性.
对数秩检验和 Kaplan-Meier 分析分析存活率的差异。
一、PLOD1在间充质GBM中表达水平较高，且与患者生存差相关:
基于 CGGA数据库，检测来自不同级别、不同类型以及不同亚型的胶质瘤中PLOD1 mRNA 的表达量，发现PLOD1在高级别间充质GBM中表达量最高（图1a-d）。基因富集分析表明，间充质亚型显著富集于PLOD1高表达组，前神经亚型显著富集于PLOD1低表达组（图1e）。Kaplan-Meier 生存分析发现，PLOD1高表达组生存显著差于PLOD1低表达组（图f），且PLOD1的表达量高低对生存的影响只有在间充质亚型中有显著差异（图1i,k,l）。在 CGGA 数据集中 PLOD1 的表达与间充质亚型相关基因（CD44、FN1、LYN、SERPINE1）的表达呈显着正相关，而与原神经亚型相关的基因（DLL3、OLIG2 , NCAM1, ASCL1) 呈负相关（图1j）。此外，根据常春藤图谱数据，PLOD1 在核心中的表达高于肿瘤的外缘（图1g）。
图1
二、敲除PLOD1可抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和胶质瘤的间充质转化，并诱导其凋亡：
为了研究PLOD1在GSCs增殖和肿瘤促进中的作用，通过转染间充质GSCs MES02-GSC和MES06-GSC细胞系敲除PLOD1（图2a,b）。接着使用MTS测定法检测PLOD1敲除后肿瘤细胞的增殖活性，吸光度值显着低于对照组（图2c,d)，证实 PLOD1 敲除能够抑制GSC的增殖。随后，通过 transwell 测定检查了 PLOD1 敲除对肿瘤细胞侵袭的影响，与对照组相比，PLOD1敲除后肿瘤细胞的侵袭能力被显着抑制（图2e,f）。此外通过TUNEL检测以及神经球形成试验，可以发现PLOD1 敲除显着促进了肿瘤细胞的细胞凋亡（图2h,i），且敲除后神经球的增殖活性远低于对照组（图2k,l）。极限稀释法也显示PLOD1敲除后肿瘤形成减少（图2g,h）。最后蛋白质印迹分析显示在 MES02-GSC 和 MES06-GSC 中敲除 PLOD1 后，间充质标记基因 CD44 和 YKL40 的表达显着降低（图 2m,n）。
图2
三、PLOD1可以调节GSCs中的NF-κB信号：
接着进一步探索 PLOD1 调节 GSC 增殖、侵袭和间充质转换的可能信号通路，对 TCGA 和 CGGA 数据集进行了 GSEA。结果显示，在高PLOD1表达组中NF-κB信号通路显着富集（图3a）。因此，通过蛋白质印迹检测了 PLOD1 调控后 NF-κB 信号通路的变化。结果显示p-P65、p-IκBα和p-IKKα/β的表达水平在PLOD1基因敲除后显着下调（图3b,e,f）。在 PLOD1 过表达细胞系中再次获得了相反的结果（图3c,f,i）。荧光素酶报告基因检测表明，PLOD1 敲除降低了 MES02-GSC 和 MES06-GSC 中 pGL3-wt 的荧光素酶活性（图3d,g）。在 PLOD1 过表达后获得了相反的结果（图3j,k）。此外，为研究 PLOD1 与 NF-κB 信号传导的任何调节分子之间是否存在直接关联，进行了 CoIP 并发现 PLOD1 可以在两个 CoIP 测定中与 IκBα结合（图3l）。
图3
四、PLOD1通过NF-κB信号通路促进GSCs增殖和MES转化，抑制其凋亡：
为了进一步验证 PLOD1 是否通过 NF-κB 信号通路促进 GSC 的恶性进展，在 PLOD1 过表达后用 JSH-23（NF-κB 信号通路的抑制剂）处理 PN03-GSC、PN04-GSC 细胞系(图4l），通过MTS 测定（图4a,b）、Transwell 检测（图4d,e）、TUNEL 检测（图4f,g）以及神经球形成试验（图4h,i），发现PLOD1能够通过NF-κB信号通路促进GSCs增殖、侵袭，并且抑制其凋亡。极限稀释分析显示类似趋势（图4j,k）。蛋白质印迹分析还发现 PLOD1 过表达促进了间充质标记基因 CD44 和 YKL40 的表达，而它们的表达在由NF-κB 信号通路的抑制剂处理后被下调（图4c），这证实PLOD1还能通过NF-κB信号通路促进间充质（MES）转化。
图4
五、HIF-1 在缺氧条件下直接转录调节 GSC 中 PLOD1 的表达：
进一步研究 PLOD1 在 GSC 中过表达的上游机制。基于 TCGA 和 CGGA 数据集的 GSEA 分析都揭示了在较高 PLOD1 表达组中显着的缺氧富集（图5a）。缺氧诱导因子-1 (HIF-1) 是缺氧条件下最重要的转录因子。因此，进一步讨论了 HIF-1 和 PLOD1 之间是否存在转录调控关系。在缺氧条件下处理 MES02-GSC 和 MES06-GSC，并通过 qPCR 和蛋白质印迹测试 PLOD1 表达，证明 HIF-1 和 PLOD1 表达都随着缺氧时间的延长而大大升高（图 5b,d）。通过 JASPAR 分析进一步确定了 HIF-1 在 PLOD1 启动子区域上的两个可能的结合位点（图5e）。PCR和蛋白质印迹进一步证实，在MES02-GSC和MES06-GSC中HIF-1过表达后，PLOD1表达显着上调（图5i,j）。最终得出结论，HIF-1 在缺氧条件下直接转录调节 GSC 中 PLOD1 的表达。
图5
六、PLOD1可以促进裸鼠的肿瘤发生、MES转化、增殖:
最后，为了确定 PLOD1 是否可以在体内调节 GSCs 的肿瘤发生和 MES 转换，研究者将 PLOD1 敲除、过表达和 PLOD1 正常表达注射到裸鼠的大脑中。与对照组相比，PLOD1 敲除显着抑制了 MES02-GSC 中颅内肿瘤的生长（图7a,c) ,并且延长了小鼠的生存时间（平均生存期：32.8 ± 8.33、61.2 ± 10.21 和 59.2 ± 10.19 天；图 7e）。相比之下，PLOD1 过表达细胞系 PN03-GSC 具有明显更大的肿瘤体积（图 7b,d）。进一步对致瘤组织进行HE染色和免疫组化染色，PLOD1敲除组PLOD1、CD44、ki-67和p-P65的强度和表达水平明显低于对照组（图7g-l）。最后，通过模型图展示了 PLOD1 在发生、增殖、抗细胞凋亡和 MES 转换方面调节 GSCs 行为的可能机制（图7k）。
图6
手术切除联合放疗和化疗是 GBM 的经典治疗方法，但它往往容易复发并最终导致患者死亡 。尽管近年来出现了免疫疗法、干细胞疗法和纳米技术等新疗法，但 GBM 的治疗预后仍然很差 。目前，针对与 GBM 发生和发展相关的致癌基因的分子靶向治疗被更广泛的认为是治愈 GBM 的有望方法。
本研究发现PLOD1与GBM的发生、发展和预后不良密切相关。尤其是在间充质GBM中，PLOD1通过NF-κB信号通路调控GSCs的增殖、侵袭、MES转化等恶性行为。此外，在作为其上游机制的缺氧环境下PLOD1 的过表达由 HIF-1 转录调控。因此，PLOD1 有可能成为 GBM，尤其是间充质 GBM 的有效治疗靶点。
PMID: 33420370
Reference: Hypoxia-induced PLOD1 overexpression contributes to the malignant phenotype of glioblastoma via NF-κB signaling
DOI: 10.1038/s41388-020-01635-y