联合外泌体RNA和ctDNA的液体活检，对EGFR突变的检测最为有效

对癌症的分子复杂性和致癌驱动因素的作用日益深入的理解已经使得癌症的治疗越来越有针对性。通常在诊断时，医生利用获得的肿瘤组织进行活组织检查从而获得靶向治疗所需的分子分析结果。然而，肿瘤组织活检有几个局限性，包括手术的创伤和由于肿瘤异质性或者低肿瘤细胞比例导致假阴性结果的风险。另外，多达49％的晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）没有获取的肿瘤组织。因此，通过体液如血液或尿液进行的肿瘤相关突变的非侵入性检测是基于组织活检方法的最有吸引力的替代方法。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是从肿瘤部位释放到癌症患者血液中的循环无细胞DNA（cfDNA）的组成部分，ctDNA作为非小细胞肺癌和其他癌症的肿瘤组织活检的替代物，具有巨大的应用前景。这使得最近美国和欧洲的血液EGFR伴侣诊断试验的监管批准。此外，已经开发出高度敏感和选择性的技术来解决癌症患者血液中经常发现的相对于野生型的极低比例的肿瘤来源的突变DNA的检测。在这方面，基于数字PCR技术的BEAMing（Beads,、Emulsification、Amplification、Magnetics）技术可以识别低至0.02%突变等位基因（MAF）的突变，已被证明是最敏感的ctDNA的突变检测，并且与下一代测序（NGS）技术达到了相似的水平（0.05％MAF）。除此之外，还需克服的困难是患者的体细胞基因的改变带来的少量的ctDNA检测是目前的肿瘤生物学无法完成的。可检测ctDNA的患者的比例因其适应症、疾病阶段、肿瘤负荷和其他临床特征而异。在NSCLC中，EGFR激活突变的患者（包括外显子19缺失和外显子21的L858R点突变）是可以接受各种EGFR抑制剂治疗的，并获得FDA批准的首例液体活检项目。在使用第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）来治疗EGFR T790M抗性突变的复发性NSCLC患者时，由于血液中ctDNA的水平有限，T790M检测的假阴性率经常>30％。第一个FDA批准的Rochecobas®EGFR Mutation Test v2 for T790M的灵敏度仅为58.4％，特异性为80.4％。

克服ctDNA突变检测数量限制的一个手段可能会是来自外泌体的肿瘤相关RNA。外泌体是由活细胞（包括肿瘤细胞）释放的小囊泡，并携带RNA、DNA和蛋白质。使用外泌体RNA（exoRNA）来识别肿瘤起源的体细胞突变先前已被证明，但exoRNA和cfDNA二者的组合（exoNA）尚未被阐述，也没有阐述比单独使用ctDNA的优势。外泌体的一个重要特征是，存在于血浆和其他生物流体的核酸是在这些囊泡的内腔中的，这些核酸结构完好，免受核酸酶的消化，是良好质量的RNA。此外，外泌体从由活细胞中主动释放出来，而ctDNA则是通过细胞凋亡或坏死从死亡细胞中释放出来的。研究人员推测，外泌体RNA上存在的额外突变以及它们来源于活跃生长的肿瘤细胞可能有助于改进目前基于血浆的EGFR突变检测。

图1：该临床试验中NSCLC患者的分组情况

在这项发表于Annals of Oncology杂志（IF 11.854）的研究中，研究人员分析了来自IIIB和IV期NSCLC患者参加TIGER-X试验（第三代EGFR抑制剂rociletinib的1/2期临床试验，编号NCT01526928）的84个血浆样品。研究人员分离外泌体和ctDNA，并提取核酸，并使用有针对性的NGS分析（EXO1000）来筛选EGFR突变。该研究的主要目的是检测同时提取exoRNA和ctDNA是否会增加拷贝数和EGFR突变检测的敏感性，尤其是在通过肿瘤活组织检查已知EGFR突变阳性的患者中，不通过只单独的分析ctDNA鉴定EGFR突变检测。研究人员将数据与匹配的组织数据进行比较，并匹配先前用BEAMing获得的ctDNA结果。此外他们通过分析治疗15天后收集的血浆，检测了治疗期间EGFR突变水平的变化是否与治疗结果相关。

图2：联合外泌体RNA和ctDNA的exoNA检测效果和单独ctDNA检测效果的比较

研究结果发现，对于exoNA（exoRNA和cfDNA二者的组合），检测EGFR激活突变的灵敏度为98％，EGFR T790M为90％。BEAM对ctDNA的敏感性分别为82％，T790M为84％。在一胸内转移亚组患者中（M0/M1a; n=21），利用exoNA的检测，EGFR激活突变的检测灵敏度从26％上升到74％（p = 0.003），T790M的灵敏度从19％上升到31％。综上所述，exoRNA和ctDNA的联合检测增加了血浆中EGFR突变检测的敏感性，并在已知具有低水平ctDNA的M0/M1a患者中看到检测的改善，该方法也对于仅基于ctDNA的突变检测提出了新的挑战。

参考文献： Krug AK et al. Improved EGFR mutation detection using combined exosomal RNA and circulating tumor DNA in NSCLC patient plasma. Ann Oncol. 2017 Dec 5.