怎样利用CRISPR技术进行靶点识别和药物发现？ / 四六文摘

癌症发生的主要原因是基因突变导致致癌基因通路失调，进而促进了癌细胞生长。

对于药物开发者来说，利用肿瘤的这些分子特征可以指导药物开发，从而获得更好的临床结果。

然而，癌症药物开发中90%的失败原因主要是缺乏有效的靶点。

一个好的靶点应该是：

安全——不会导致毒性副作用

有效——产生有效的治疗效果

可成药——可以开发成药物分子，能产生可量化的生物效应

因而，找到一种有效的靶点发现方法可以降低长周期、大投入的药物开发失败风险。

01 利用CRISPR进行靶点筛选

功能基因组学的目标是将基因型与生物表型联系起来，而CRISPR-Cas9技术使研究人员能够对整个基因组进行筛选，以研究基因表达变化对功能的影响。这为靶点发现开辟了新的方法。利用全基因组sgRNA文库可以进行高特异性的基因功能获得性研究和基因功能缺失性研究。将sgRNA慢病毒文库转染细胞，sgRNA表达元件可以稳定地整合到基因组上，有效地为每个细胞提供条形码标识，因而可以对混合细胞池进行筛选。在加压筛选之后，通过NGS分析进行阳性或阴性筛选，可以很容易地从混合细胞池中识别出被富集或被消减的sgRNA。这种高效且无偏性的靶点筛选方法有望提高新药的成功率并加速新药的开发。

关键点

识别与疾病相关的靶分子是药物发现过程中的第一步

CRISPR-Cas9提供了一种高效且无偏好性的靶点筛选方法

全基因组sgRNA文库可用于进行基因功能缺失性或基因功能获得性筛选，探究肿瘤进化机制，寻找肿瘤治疗靶点

CRISPR-Cas9筛选可用于高效探索药物机制，确定癌细胞进程的分子基础：如联合致死性、药物相互作用、衰老和肿瘤特异性信号通路；

还可以用于开发联合用药

02 利用CRISPR-Cas9技术寻找联合靶点

通过sgRNA文库筛选，发现那些经过药物处理后消失的sgRNA，进而发现对药物处理敏感的敲除基因。例如，利用CRISPR文库筛选发现在胰腺癌细胞中敲除某些基因后，胰腺癌细胞会对MEK抑制剂敏感。

反过来，也可以利用CRISPR文库筛选给药处理后被富集起来的sgRNA，进而研究其耐药性机理。例如Hou等人通过CRISPR文库筛选，发现了对FLT3抑制剂产生耐药性的基因（FLT3抑制剂是正在进行临床试验的急性髓系白血病治疗药物）。

案例分享

研究背景

胰管腺癌(PDAC)是最致命的癌症之一，其平均存活时间为6 - 12个月。多个信号通路参与到肿瘤发生过程中，其中RAS-RAF-MEK-ERK通路为癌细胞提供生存信号，是肿瘤形成的主要驱动因素。因此，人们认为靶向抑制MEK信号通路是很有前景的疗法。然而，单独使用MEK抑制剂或联合使用吉西他滨在PDAC的治疗中并没有显示出理想的疗效。

研究方法

使用大规模CRISPR基因敲除文库筛选，以确定：在MEK信号通路受到抑制的情况下，哪些基因的敲除可以改变PDAC细胞的存活。使用胰管腺癌的PDX模型进行体外和体内KO筛选，发现了几个潜在的治疗靶点基因，这些基因的敲除都会协同性增加细胞对MEK抑制剂的敏感性。这些靶点的作用都在进一步的基因敲除和小分子抑制剂实验中得到确认。

构建覆盖4000个基因的47234条sgRNA病毒文库，靶向表观遗传调节因子、转录因子和核蛋白基因。以0.3的MOI值转染1.5-2.0×108个细胞，抗性筛选一周后，将存活细胞随机分成9组，每组包含8×106个细胞（覆盖200×sgRNA），其中1组在Day 0时收获备用，剩余的分别用于体外筛选实验和PDX小鼠体内实验（将细胞接种到裸鼠胰腺中，共接种6只小鼠）。注射1周后，动物随机接受对照处理（n=3）或曲美替尼处理（n=3）4周。然后通过NGS测序分析，评估每个sgRNA的相对丰度。同时，还进行了体外筛选实验，将细胞分别使用DMSO（对照）和曲美替尼处理4周。

研究结果

在曲美替尼处理组中，肿瘤中富集的sgRNAs表明，这些基因靶点的KO提高了药物治疗的整体适应性；而sgRNAs的缺失表明，抑制这些基因靶点会使细胞对药物处理更加敏感，从而为联合治疗提供一个新的有效靶点。值得注意的是，这些缺失的sgRNAs都是针对有丝分裂细胞周期和着丝粒功能的，如CENPE、NUF2、MIS12和CENPI。

以CENPE和RRMI为例，它们仅在曲美替尼治疗组的肿瘤中显著消减。

为了进一步证实CENPE和RRMI基因敲除与曲美替尼治疗的关系，文章使用CRISPR/Cas9技术又分别在PDX366和mPanc96细胞中对CENPE和RRM1进行了敲除并进行曲美替尼药物处理。结果发现：与对照相比，CENPE和RRM1敲除细胞对曲美替尼处理更敏感。

为了进一步解释这种条件致死性背后的潜在机制，文章同时也使用了靶向CENPE和RRM1蛋白的小分子抑制剂。为了靶向CENPE，文章使用GSK923295变构抑制剂；为了靶向RRM1，文章使用了COH29，COH29可以靶向结合肿瘤细胞系中RRM1的配体结合区。结果显示，MEK和CENPE抑制剂联用或者MEK和RRM1抑制剂联用，在三种胰腺癌肿瘤细胞系的不同药物浓度组合下都显示除了强烈的协同作用，有效抑制了肿瘤细胞生长。

CENPE靶点

RRM1靶点

究结论

寻找联合靶点是临床癌症研究中提高化疗疗效的主要目标手段。通过大规模的体内、体外外CRISPR敲除文库筛选，作者在胰腺癌细胞中，发现了可以协同提高MEK信号通路抑制作用的基因敲除靶点和小分子抑制剂。此外文章还表明，CRISPR敲除后活率评分与基因表达水平相结合，可以模拟肿瘤细胞对药物处理的响应度。

写在最后的话

使用CRISPR-Cas9基因组敲除文库，结合NGS的快速分析，使科学家们能够找出许多潜在的药物靶点。然而，这个筛选方法也有一些限制。一个潜在的问题是，完全的基因敲除有可能不能很好的模拟药物作用效果。Rene Bernards在2019年的AACR会议上说，“没有一个药物会100%抑制基因的活性”。因此，与完全敲除相比，CRISPRi可能是更好的办法，dCas9靶向转录起始区域进而抑制基因的转录。

参考文献：

1. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C. &Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs.Nature Biotechnology 32, 40–51 (2014)

2. Szlachta, K. et al. CRISPR knockout screeningidentifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellulardrug response. Nature Communications 9, (2018)

3. Hou, P. et al. A Genome-Wide CRISPR ScreenIdentifies Genes Critical for Resistance to FLT3 Inhibitor AC220. CancerResearch 77, 4402–4413 (2017)

怎样利用CRISPR技术进行靶点识别和药物发现？

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