过表达载体构建流程及注意事项

表达基因扩增的引物设计：

1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；

2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突（可使用primer premier5 软件或南京德泰生物镜像（网站））；

3. CDS区首、尾序列 + 5’端加上酶切位点和（或）保护碱基（如下图）。

表达载体构建简要流程

1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；

2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；

3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。

常见问题

1. 引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来

在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；

人基因ORF库购买。

2. PCR产物酶切不成功

构建克隆载体，再酶切；

载体自连会使Lac Z编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。

3. 没有合适的酶切位点

无缝克隆试剂盒。

4. 没有合适的抗体

加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；

引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；

载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。