捉拿原凶，让致命敌人无处躲藏--什么是二代测序
秋冬季节，各种感染性疾病的高发时段即将到来。尤其是疫情时期，做好防护传染疾病的工作尤为重要。人类从正式认识到病原存在并与之斗争已经经历了几个世纪的时间，期间付出了数以亿计生命的代价。然而迄今为止，感染性疾病依然是严重的公共卫生问题和造成人类死亡的重要因素。
据世界卫生组织（WHO）统计数据显示，全球每年约有1,500万人死于感染，约占全球每年总体死亡率的25.5%。尽管这其中大多数感染性疾病只要得到及时、准确的诊断，并给予科学合理的治疗，都有可能在相对较短的时间内彻底治愈。然而很多时候，最基本的“病因”诊断才是最难的部分。
作为一名重症医学科的医生，我们接触到的往往是最为凶险、复杂类型的感染。它们无论感染来源和病原体类型不同，一旦合并危及生命的器官功能障碍，即被冠以一个共同的名字，即脓毒症。脓毒症的发作意味着高达28-50%的死亡率和高昂的治疗费用（数万元到十余万元）。遗憾的是尽管我们付出巨大的努力，当前脓毒症的病原诊断依然小于40%。这其中，脓毒症本身的复杂性自然不必多说，传统检查手段的局限性也占据重要原因。因此，医生会考虑给患者进行基因学检查更为精准的查找感染来源。
传统病原学检查手段的局限性
1、 传统培养方法
这几乎是每一个严重感染的患者都会接受的实验室检查。医生们试图将致病菌在培养皿上还原出来，一旦出现阳性结果，因其最高的循证医学证据基本可以作为金标准指导临床治疗。但该技术培养阳性率低（10-30%）、周期长（3-5天）和部分病原体难以培养（苛养菌），因此难以赶上疾病的进展速度。
2、 免疫学方法
临床医生还会根据病人的其他实验室检查结果（血常规、C反应蛋白等）缩窄诊断目标范围。进一步通过抗原抗体试验定向筛查常见的病原体类型，如新冠病毒抗体、乙肝两对半检查等。但这种方法覆盖的病原体有限，对于罕见类型的病原很难检出。
3、 分子诊断方法
分子诊断方法常用的技术为PCR（聚合酶链式反应），在时效性（数小时）和敏感性上优于以上检查。但其选择思路依然没跳出上述方法。
新兴诊断方法的到来
自从2016年第一次被美国食品药品监督管理局（FDA）推荐用于感染性疾病检测后，病原宏基因组检测 (metagenomics Next Generation Sequencing, mNGS)检测在中国经历了快速发展的5年。并于2020年正式通过张文宏教授起草的《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体临床应用专家共识 》推荐应用于感染性疾病的诊断领域。
mNGS的定义是一种无需预设，无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中的DNA/RNA，进行高通量测序，经过专用病原数据库比对与生信分析，一次性完成细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体的检测手段。
从上图中我们即可以看出，mNGS检测的核心点在于将组织标本中的核酸物质（DNA/RNA）进行测序后同专业的病原体数据库进行比对。因此理论上一次样本检查足以完成现有国际上全部被发现的病原体基因序列筛查，具有精准、全面的特点，能够对罕见类型、机会致病病原体进行有效筛查。其次，从样本采集到专业人员的报告分析仅具有5个步骤，平均获取实验结果的周期时间为6-48小时，时效性很强。当前，关于mNGS检测的临床应用已经有大量的病例报道发表，得到国内外同行的广泛认可。
下图中显示的是一名86岁女性病人，来我院是由于外院肺部CT检查高度怀疑肿瘤。同时病人合并非常严重的呼吸困难，随时可能需要气管插管呼吸机辅助支持。在当地医院病人已经完成大量传统实验室检查，但结果都是阴性的。收入我科后我们考虑患者病情严重，不能继续耽误病情，因此在当天完善mNGS检查。24小时内结果即回报罕见病原体：鹦鹉热衣原体。予以针对性抗感染治疗2周后，患者病情明显好转出院。找到了明确的病原体，这名重症病人的治疗一下子就变得那么简单。
但是，mNGS这种检测也有很多自身的问题，比如检测费用高昂（3-5000元/样本），标本必须遵守严格的无菌要求，循证医学支持证据不高的缺陷，都限制了其临床应用的推广。因此，一系列的专家共识都对mNGS检测的规范化提出了更高的要求。mNGS需遵循以下诊疗思路。
1、 对病人整体病情的评估
临床疑似感染的病重、病危患者，对病原快速检测需求较高
免疫抑制、免疫缺陷等特殊类型患者，极易出现罕见病原体感染
2、检测项目的选择
DNA检测：适用于怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体等绝大多数患者
RNA检测：怀疑RNA病毒感染，如流感病毒、CoV-19和新型布尼亚病毒等
3、标本取材
取材范围含临床工作可获取的绝大多数标本类型静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。无法检测的为粪便和骨头。
4、检测结果解读
若mNGS结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据mNGS结果指导临床决策。
若mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏除mNGS结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证 (在具有合适引物的条件下)，并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。
若mNGS结果阴性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。
5、伦理学的规范化
检测公司有义务做到销毁或退回未使用的样本，并且不得进行约定合作范围以外的检测行为。以上行为需要有专门的法律法规条款进行约束和管理。
当前，mNGS在国内正处于蓬勃发展阶段。随质量控制、报告解读等方面逐步完善，大样本量研究将会加速标准规范建立。但是关于感染性疾病的精准医疗之路还远不止于此。未来我们期待mNGS及其下一代技术会成为临床及微生物学家不可或缺的诊断工具，引领微生物检验新的时代。
作者：
静亮，武汉同济医院重症医学科主治医师
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