悬浮细胞基因敲除技术构建流程详细介绍
1. 悬浮细胞选择:
增殖快,容易形成克隆,细胞无多倍体现象,细胞不会出现分化,培养基简单,没有支原体污染;
2. 悬浮细胞检测:
1)细胞倍增时间检测
2)细胞的安全检测
3)细胞的基因拷贝数查询
4)细胞的转染效率测试
3. 细胞基因敲除策略:
1)可以使用片段敲除的策略
2)细胞敲除的基因对细胞增殖没有影响(如果有影响一定要使用单克隆扩增)
4. 敲除细胞单克隆:
1)极限稀释法,通过不断的稀释使得每个孔只有一个细胞;
2)由于悬细胞的悬浮增殖,很难判断每个液体层都没有细胞;
5. 基因敲除功能验证:
1)先要对细胞做PCR检测,保证片段敲除;
2)Q-PCR检测看看在mRNA水平的敲除效果;
3)做WB看看蛋白的效果和生物表型的影响。
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