当前，我们需要一种跨物种、跨疾病可迁移的神经影像分析工具，静息态功能磁共振方法是一个合适的此类工具。它可以研究大脑的连通性，在人类和其他灵长类动物中，功能连接模式都有与之相对应的结构连接基础。考虑到近来小鼠模型在神经影像研究中的广泛应用，探究小鼠功能连接可能存在的结构基础，就成为了一个值得研究的方向。这里我们基于艾伦图谱比较了雌性小鼠静息态功能连接与基于病毒示踪剂的结构连接之间的相关性。研究表明在左右脑之间的相同脑区，如皮层、海马以及皮质-纹状体的通路中的功能连接主要通过单突触连接实现。此外，我们还证明了纹状体可以针对不同的静息功能连接模式进行分割。相对来说，对于某些皮层下网络，功能连接往往沿着多突触途径出现，如左右纹状体，虽然它们不直接共享结构连接，但是其高度的功能连接可能是皮层自上而下控制驱动的。最后，我们发现可能受到麻醉、脑区大小以及示踪剂剂量的影响，小鼠皮层到丘脑通路上的功能连接受到抑制。这些发现为将静息态功能连接作为迁移式研究工具来研究复杂脑网络之间的相互作用，并作为跨物种以及跨神经疾病的病理研究的重要工具提供了关键基础。本文发表在The Journal of Neuroscience杂志。（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料） 思影曾做过多期动物脑影像研究文章解读，欢迎点击以下链接浏览：
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大脑依赖于神经调节和强大适应性的神经网络来实现感觉、认知以及行为的精准控制。而神经网络在不同尺度上的组织被认为是大脑信息整合调配的必要条件。神经网络不仅可以在结构层面进行识别也可以分别在细胞层面通过示踪剂来认识两个神经元的连接。在功能分析的层面上，依赖于神经以及突触之间的活动进行识别。然后可以将关注脑区抽象为节点，用节点之间连边的强弱来衡量脑区之间的相互作用。而这种架构对于定义大脑内部由于疾病而产生的连接改变十分重要。通过静息态功能成像就可以提供这种潜在的功能连接信息。静息态fMRI通过衡量两个脑区血之间血氧信号波动的同步性来估计脑区之间在统计上的依赖性。有人提出远程脑区之间的高功能连接可能是通过解剖结构上的连接产生的，这表明某些新发现的功能网络可能间接反映了其潜在的结构连接。有很多工具与研究方法可用于结构连接分析，基于活体检测的有弥散加权成像及其追踪的方法，也可基于离体标本构建细胞水平的解剖学连接图谱。对于人类的研究中，基于弥散张量数据的纤维追踪作为一种非侵入式的研究结构连接的方法，适用于多中心数据分析，也成为了该领域唯一的一项选择。然而这种基于追踪的结构连接分析无法解决纤维交叉问题，对于灰质的敏感性较低，且无法提供纤维追踪的起始问题。在没有道德伦理限制的情况下，在动物模型中使用顺逆行病毒示踪剂可以不受到纤维交叉的影响，被认为是单突触通路研究的金标准。近来基于病毒示踪剂的追踪技术被广泛应用到中等尺度的脑结构分析上，用于绘制出小鼠在突触层面上的结构连接。而这种研究方法在动物模型中可对于非侵入式追踪的结果进行验证。同时这种模型与人脑网络架构有一些共通的关键原理。过去这种结构与功能的差异受限于功能影像的数据质量不易开展。而现在随着技术的发展与进步，使用先进的技术与方法可以获得高分辨率、高质量的影像学数据用于构建小鼠的功能连接网络，这样我们就可以将其与基于艾伦脑图谱的结构连接网络进行比较。
我们的研究也证明了在有结构连接基础的脑区间有着较高的功能连接。除了左右半脑镜像脑区之间的强连接外，我们还发现小鼠的纹状体（STR）可以根据皮层不同功能模式进行分割。有趣的是，我们还发现在左右半脑皮层下结构之间的强功能连接伴随多突触通路的出现，这说明新脑皮层（新脑皮层是由侧脑室外壁的神经物质生长而成，并包围着初生脑皮层（原脑皮），古脑皮的残余称为梨状叶，原脑皮的残余称为海马，在侧脑室内，仍为嗅觉中枢。大脑皮层由发达的新脑皮层构成，它接受来自全身的各种感觉器传来的冲动，通过分析综合，并根据已建立的神经联系而产生相应反应）或许是连接左右半脑的重要中继区。相对而言，可能由于受到麻醉、ROI大小以及示踪剂注射剂量的影响，限制了小鼠沿皮质-丘脑方向上的功能连接。这些研究结果为以后在人类疾病的小鼠模型中，以脑网络连接的变化来揭示脑连通性是如何伴随病理表型改变而改变的研究工作提供了重要基础。
为探究功能连接潜在的结构基础，我们采集了14只雌性C57BL6小鼠的静息态功能影像数据用于计算其功能连接并与基于示踪法得到的结构连接进行比较。功能连接的计算同样基于艾伦脑图谱，将大脑划分为多个脑区，计算两两脑区之间的皮尔逊相关并作fisher-z变换后进行比较。功能连接与结构连接的一致性分析可通过以下方法进行分析：1、作斯皮尔曼偏相关，并将脑区的体积作为协变量消除由于区域大小造成的主导效应；2、是可以使用ROC曲线分析方法判断一致性；3、按照赢家通吃的规则，将每个体素划入与其连接值最大的网络。最终通过基于图论的分析方法，我们比较了结构连接和功能连接下节点之间的距离，由此得到了单突触和多突触下的连接依赖特性。基于病毒示踪剂注射的结构连接分析方法源于Oh等人的研究。简而言之，将含有编码增强绿色荧光蛋白基因的腺病毒顺行示踪剂定向注射到小鼠的不同部位。注射2周后荧光蛋白质产生，然后提取大脑组织切片，用双光子显微镜成像，重建为3D荧光图，并转化到共同的参考空间。通过每个ROI的荧光并根据注射量对其进行归一化，确定了从注射种子点到目标区域的连通性。我们将分析范围限制在fMRI采集完全覆盖的Allen图谱的大脑组织：异皮质、皮质下结构（CTXsp ）、海马功能区(HPF)、纹状体（STR)和丘脑。ME-EPI数据首先转换为NIFTI格式文件，后续的处理使用基于python的脚本实现包括，运动校正、尖峰处理以及4D图像的独立成分分解等处理。各个成分都将会对其时间依赖性进行评估，并识别其是否为血氧依赖性的独立成分，对于非血氧依赖的独立成分，我们会将其标注为噪声通过回归的方法，进行降噪处理。降噪后的影像数据将会用ANTs工具通过线性仿射变换以及SyN变换算法，将其配准到标准脑上。大尺度功能网络成分使用FSL工具包中的MELODIC工具进行评估与分离。在最终获取的30个成分之中，我们确定了17个包含皮层核团的大尺度功能网络。而其他成分在空间分布上并未包含大部分灰质区域，说明其是与生理信号无关的其他成分。其中也并未发现与运动以及血管相关的成分。这些与前人的研究是一致的。在FSL中基于GLM原理和示踪分析以及图谱，确定了238个静息态的种子点。基于脑图谱我们计算其中脑区两两之间的皮尔逊相关，并对相关值作fisher-Z变换以比较两组连接之间的差异，统计上使用FDR方法限制显著性水平，降低假阳率。示踪实验得到的结构连接与功能连接的相关性可使用基于斯皮尔曼偏相关分析方法来进行评估，同时以脑区体积为协变量，以消除示踪剂含量受区域体积的影响。对于结果，我们按照影响的强弱进行划分：0~0.2为零或弱影响；0.2~0.4为弱到中强度影响；0.4~0.6为中强影响。由于我们无法轻易得假设示踪剂强度与结构连接之间的线性关系，所以我们在此使用了非参数性的斯皮尔曼相关分析探究功能连接与结构连接的相关性。结构连接和功能连接的子网络在其解剖从属结构中进行选择，通过对数转换归一化在0到1之间，并使用多个阈值对连接矩阵进行二值化。以基于示踪剂的追踪分析为基础，用ROC方法比较这些不同阈值下的功能连接矩阵。通过真阳性和假阳性数据构建ROC曲线，通过AUC（曲线下面积）衡量两个矩阵的相似性。然后使用置换检验将AUC结果与相同数据集的零分布进行比较。因此，在每个排列中，标记所覆盖的大脑的总体积在结构连接和功能连接之间是相同的，这排除了结果值中由于体积导致的误差。
Figure 2相同种子下结构连接和功能连接的比较
我们基于oh等人的研究，创建了81个脑区作为节点的结构脑网络，通过图论的分析方法确定单突触与多突触的连接方式。基于相同的脑图谱，通过脑区两两之间时间信号的皮尔逊相关来构建对应的功能连接网络。不预设mask，只通过计算所有独立被试组平均的方式保留所有被试的原始分布。所有的连接矩阵都归一化到0到100之间，并用0到100的100个阈值进行二值化处理，使用R语言作ROI之间距离的比较。在每个阈值数据中，根据结构连接以及功能连接的距离划分为三类：1、单突触连接模式（结构连接距离有一条连边，功能连接距离有一条连边）；2、多突触连接模式（即结构连接距离大于1，功能连接距离等于1）；3、非对称连接模式（即结构连接距离大于1，功能连接距离也大于1）。最后我们将各个类别连接的可能性确定为每个阈值水平下的发生概率。
所有诸如功能连接数据与结构连接数据的相关性，以及与病毒度注入量的斯皮尔曼偏相关都通过配对样本T检验来比较差异。对于ROC分析，则通过置换检验AUC与ROC的显著性，以测试其对于0分布的显著性。如果您对动物脑成像及人脑影像分析感兴趣，欢迎浏览思影科技课程及服务（可添加微信号siyingyxf或18983979082咨询）：
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结构连接与功能连接是描述大脑架构的不同指标。基于艾伦脑图谱得到的基于病毒示踪的结构连接以及基于功能像得到的功能连接都会被标准化到标准坐标体系中。通过4个选定注射点的病毒示踪分布以及基于种子点的功能连接分布，提供了结构连接与功能连接差异的定性表示。以注射在初级体感功能区域附近的病毒示踪分析为例，发现了其向同侧以及对侧初级体感功能区，还有左背侧STR(纹状体)和丘脑的连接。基于种子的功能连接也表现出类似的连接模式，在背侧STR以及同侧和对侧半球之间有显著的功能连接，而与丘脑则没有明显连接。对于运动区域以及前扣带区域的种子点，我们发现其结构连接与功能连接有显著的重叠。这种情况下，显示高功能连接的区域会超出单突触连接区域，对于运动区种子点而言，它的连接区域包含了主要的体感皮层区域，而对于前扣带种子点而言，主要包括了后压皮质区域。最后在齿状回种子点的连接分析发现，结构连接仅局限于海马体，而相应的功能连接则延伸到了整个海马区、扣带回、后压皮质、腹内侧以及周围的神经皮层区域，而这些区域就是人们认为啮齿动物默认网络组成的主要区域。这表明特别是左右半球的同源皮质区域的功能连接，可能是基于直接的单突触连接出现的。而如DMN这样的大规模网络脑区之间的功能连接，可能也有其结构基础。进行全脑范围的比较，我们使用了238个病毒示踪图重构的所有单突触连接矩阵，并将其与基于种子点的功能连接相匹配。其中我们的注射区域包括：98个新皮质区域，HPF(海马功能区)39例，CTXsp 6例，STR33例，PAL8例，以及54例丘脑。而同侧以及对侧目标区域的选自艾伦脑图谱。基于病毒示踪得到的结构连接模式以及基于种子点的功能连接的联通模式证实了在皮层注射区域表现出的相似性，即其在同侧以及对侧皮层以及皮层下核团均表现出高结构连接和功能连接。然而，对于其他特定的连接，如新皮质和丘脑之间的连接，尽管有密集的单突触连接，但大多没有功能连接。关于HPF，除了同侧和对侧的丘脑之外，在位于内嗅皮质区朝向新皮质和皮质下结构的注射位点之间观察到强结构连接。然而，在功能连接矩阵中没有观察到这种模式。偏斯皮尔曼分析也证实了功能连接和结构连接对大多数选定种子的总体良好一致性。
在新皮质中，除前额叶区域外，均发现了中等至强的相关性(0.4–0.6)。而除了腹侧后内侧核之外，丘脑的大多数种子显示零或弱效应(0~0.2)。有趣的是，结构连接和功能连接指标之间的相关程度与结构连接分析中注射的病毒示踪剂量显著相关。通过ROC分析进一步评估了大脑结构内和结构间在两种度量标准中结构连接和功能连接的相似程度。根据ROC分析估算的AUC概括了上述观察结果。特别是，在新皮质种子点和对侧新皮质之间(图3d，AUC 0.702)，以及新皮层和STR(纹状体)之间(图3e，AUC 0.709)存在显著的对应关系。对于TH和新皮层之间的连接，尽管与两个方向的零分布(图2f，AUC= 0.587)显著不同，但功能连接和结构连接之间的对应性较低。
我们对这三个相关的大尺度网络连接在映射对侧新皮质、STR和丘脑的最强烈连接分区体素水平做了进一步的分析。因为大多数从海马结构预测的发现被限制在HPF(海马功能区)内，所以它不包括在详细的分析中。结构连接网络以及功能连接网络在小鼠脑网络相似的组织模式。哺乳动物的大脑被组织成不同的大规模结构，或可称为子网络或网络模块。同一分析空间中的结构连接信息和功能连接信息的组合为比较大脑的模块化组织提供了两个独立的指标。从20个选定的新皮层注射种子(图4a)中采用的赢家通吃方法揭示了同侧和对侧新皮层的结构(图4b，左)和功能(图4b，中)模块化结构之间的显著对应关系。在这两个指标中，躯体感知运动皮层可分为三个不同的模块，包括运动(图4b，红色)、感觉(图4b，绿色)和眶内(图4b，黄色)区域。发现与时序信息处理显著关联的模块(图4b，浅蓝色/深蓝色)包括听觉和视觉皮质以及海马后区，如内嗅皮层。突出显示了与DMN类似的区域，特别是扣带回、前额叶和后压皮层(图4b，紫色)。这种模块化组织结构与之前的病毒示踪研究中提出的子网络一致。这些数据拓展了前人的研究成果，该研究中，小鼠大脑被划分为两个皮层网络模块，包括外侧皮质网络以及默认网络，也包括了研究中发现的颞叶相关模块。
尽管新皮层具有模块化组织，但单个体素很可能并非只与一个模块相互连接。为了比较结构和FC特征，我们为mask内的每个体素进行了连通性分析。然后，我们使用斯皮尔曼相关分析方法，用来自所有等皮质种子实验的数据关联每个体素处的结构和功能连接，并使用FDR校正多重比较(p > 0.05)。该分析强调了对于每个示踪剂种子点，目标体素是否具有相同的高连通性或低连通性模式，以及结构连接和功能连接指标之间的这些连通性模式是否相同。该分析显示，86.9%的对侧新皮层体素在FDR校正后存活，表明结构连接和功能连接参数之间的连通性的高度重叠。具体而言，结构与功能的耦合关系在运动和内侧眼眶模块以及DMN中最强，而在感觉和时序性信息处理模块之间的区域中相关性较弱。皮质-纹状体连接路径是参与各类生心理活动的重要组成部分。这些联系中的低激活或强激活与包括自闭症和精神分裂症在内的几种神经精神障碍有关。从解剖学和功能运作的角度看，STR(纹状体)根据输入和输出区域分为不同的亚区。用赢者通吃算法获取亚区的分割情况。在结构和功能数据集上都证实了这种模块化组织，其似乎分为与扣带区、运动区、感觉区、内侧眶区和颞联合皮质紧密连接的五个宏观区域。同侧STR的划分与病毒示踪剂发现的模块划分有显著相似性。值得注意的是，87.8%的纹状体体素表现出解剖结构和功能结构之间存在显著的斯皮尔曼相关性，相关性最高的是运动皮层至背侧STR通路。丘脑是一种高度异质化的结构，可以细分为不同的区块，通过多个解剖结构与大脑皮层相连。并对感知和多种模态的信息进行汇总处理。而人类以及啮齿类动物都有相对清晰的丘脑到皮层的连接图谱可用。基于人类的研究结果在宏观水平上证实结构弥散数据和功能成像数据在总体上存在对应关系。而本研究也发现小鼠的新皮层与同侧丘脑存在一定的联系。在统计上，同侧丘脑中，只有8.8%的体素显示出与ROI的显著性联通。具体来说这些对应区域说明丘脑的腹前侧与后压皮质的分割以及腹内侧核团与运动感知脑区之间的连接。对于其他的细胞来说，基于病毒示踪的整体连接无法在rs-fMRI测量的功能数据所反映。
我们对功能连接与结构连接的比较，揭示了这两种连通性度量方法的异同。在最后针对结构连接分析与功能连接的一系列的分析中，我们确定了划分两个节点的最少边数。根据连接两个节点所需的连边数，我们将结构连接划分为3类：1、单突触功能连接，2、多突触功能连接；3、功能连接较低的失匹配单突触连接。这两种距离的度量方式都呈现出了类似的分布情况。在低阈值情况下，对于大多数脑区可以被一个或者两个连边区分开来。正如预期，节点对之间的距离会随着阈值的增大而增大，这与矩阵稀疏性的增加趋势一致。在新皮层以及同侧HPF（海马功能区）以及STR(纹状体)上都发现了较高的单突触功能连接。值得注意的是，在双侧同类型区域的新皮层在较小程度上在HPF之间发现了半球之间单突触连接的高发生概率。在大脑结构与半球之间的相互作用上，发现多突触连接的可能性更加多样，比如STR向新皮层和对侧STR以及两个半球同类型脑区之间有明显的单突触连接。相反，皮层下核团的连接更加多样，仅在少数情况下依赖于多突触连接。失配功能连接主要存在于皮层、HPF、STR中丘等节点的连边上，这与前文中丘脑弱连接的概念一致。在本文中，我们对小鼠全脑范围内的功能连接网络进行了报告，并分析了增强型长程功能连接回路如何映射到单突触连接通路上。我们证明功能连接会优先选择单突触连接出现，比如跨半球的同侧新皮层中就有此现象。我们进一步证明了rs-fMRI是研究皮层-纹状体回路的重要工具，并且其符合单突触连接的解剖特性。最后，以左右STR(纹状体)以及丘脑之间的高连接网络为例，我们确定了rs-fMRI通过多突触途径进行特定网络的同步。理解大脑结构和功能运作背后的组织原则一直是神经科学的核心问题。跨物种的趋同证据证实，fMRI测量反映了刺激诱发和rs-fMRI的神经元活动。此外，人类功能连接网络的拓扑结构很好地对应于形成皮质-皮质、皮质-纹状体或皮质-丘脑回路的主要结构纤维。然而，这些研究中许多都使用从弥散加权成像获得的信息来重建结构连接网络。但是弥散成像仍然有许多限制，如有限的空间分辨率，灰质的低灵敏度以及识别光纤交叉和终端的困难。相比之下，小鼠体内的示踪剂信息允许人们以更高的空间分辨率重建细胞水平的结构连接网络，并且在纤维交叉或单突触和多突触连接上相对清晰。与我们的工作一样，前人也将病毒示踪剂与功能连接进行比较的工作做了系统的报告，说明整个大脑中结构连接和功能连接之间的良好对应关系，尽管这些研究没有系统地研究连接体中各种网络之间结构连接与功能连接的耦合关系，或者只关注海马体等特定结构网络。我们已经能够使用广泛的静息态网络中所涉及的节点之间的已证实的真实连接来演示结构功能的对应关系，其中有许多可以对应于人类网络的类似结构。除了人脑中的左右侧额顶叶网络之外，人类和其他物种的静息态FC网络已显示出双边组织。以前对啮齿动物大脑静息态网络的研究也表明了存在这种双侧组织，这种特性在胼胝体发育不全的小鼠中丢失或大大减少，支持了轴突连接参与支持远端功能连接的观点。其中许多网络被认为类似于人类静息态网络，如DMN网络或突显网络。啮齿动物功能连接的一个有趣特征是存在稳健的纹状体功能网络，我们已多次发现其可分为三个子网络，背侧STR(纹状体)和外侧STR大多与尾状核和壳核重叠，腹侧STR与伏隔核重叠。这种向特定回路的分工很有趣，因为它们在与药物成瘾、运动障碍、重度抑郁症、帕金森病和精神分裂症相关的脑疾病的小鼠模型中受到不同的影响。这些网络的一个特定属性是，其与强烈依赖直接连接的皮层网络相比，它们的双侧组织依赖于多突触传递，或者通过皮质-纹状体通路，或者通过黑质纹状体通路。因此，纹状体网络在啮齿动物静息态功能网络中的优势地位以及脑疾病和药物成瘾小鼠模型的可用性为研究疾病对这些特定网络的大规模功能影响提供了新的机会。除了强调结构性和功能性之间的显著重叠，我们还发现了一些结构性和功能性不匹配的网络，特别是皮质-丘脑投射。这可能是由于麻醉的影响。虽然控制麻醉和机械通气有望通过减少运动和恒定的呼吸周期来显著限制生理噪声，从而提高功能读数的鲁棒性和可重复性，但麻醉剂也会影响神经网络。例如，据报道，虽然将美托咪定保持在最低水平，但它会干扰皮质-丘脑功能连接，特别是在rs-fMRI研究中，特别是以剂量依赖的方式影响表达高水平-2肾上腺素能受体(美托咪定的靶点)的区域。另一个可能的混淆因素是用于瞄准丘脑核的注射量相对较小，这种影响因这些相应核的感兴趣区域尺寸相对较小而进一步加剧。事实上，54个丘脑区域中的22个(41%)被注射了0.1升病毒示踪剂。相比之下，只有28%的新皮层和24%的纹状体注射接受了0.1微升示踪剂。小剂量注射获得的更高的解剖学特异性是小核细胞所需要的。然而，这通常是以降低病毒的转录效率为代价实现的，因此降低了测量的灵敏度；这可能在宏观尺度本体目标的连接中引入了系统噪声。此外，功能磁共振成像相对较低的分辨率加剧了这种影响，因为它不可分辨较小的丘脑亚区。值得注意的是，我们的结果显示了SC FC斯皮尔曼和注射量之间的强相关性，这证实了这些发现。这表明麻醉啮齿类动物的丘脑静息态网络应该谨慎解释，因为它们在结构连接方面的解释可能会受到测量中如麻醉等固有缺陷的干扰。其次，一项对猴子的研究表明，轻度和深度麻醉状态与功能连接和结构连接之间的相关性更强，而清醒状态下可以超出结构基础，捕捉到包括动态FC模式在内的更加丰富的连接模式。虽然很难比较不同研究之间的麻醉深度，不同物种之间的麻醉深度也更难比较，但本研究使用了轻度麻醉镇静方案，该方案保留了与清醒猴实验中描述的结果相当的反相关性和丰富的动态功能性连接模式。这可能解释了本研究中观察到的丰富的多突触依赖性纤维连接蛋白的存在。第三，来自Allen研究所的基于示踪剂的结构连接包含任意两个ROI之间的方向信息，而FC只捕获时间序列之间的同步信息，而不考虑方向。尽管最近的研究表明，小鼠顺行和逆行路径之间普遍存在良好的对应关系，但这可能会导致对这两个指标之间对应关系的估计存在偏差。的确，大多数解剖结构上突触与反向突触相结合，这可能抵消结构连接的方向性效应。海马体是这一规律的一个例外，因为大多数传播是单向的，而海马体的输入只来自para-HPF;因此，海马的远端功能连接与啮齿类动物DMN即其他模块一样，大多具有多突触特性。将因果模型如格兰杰因果关系或动态因果模型应用到静息状态网络可以提供关于方向性的信息，从而提供关于结构和功能之间的对应关系的进一步信息。总而言之，本文通过基于示踪剂的重建估计的结构连接和从小鼠中获得的rs-fMRI估计的功能连接的全脑比较表明，无论是从种子点获得的单个连通性图到全脑相互作用，还是到结构连接与功能连接耦合的模块化组织，这两个指标在几个层面上基本一致。功能连接和结构连接之间的这种密切对应关系形成了将小鼠中的rs-fMRI与其解剖学结构联系起来的基础，为研究结构与功能关系及其由于网络内疾病引起的改变提供了坚实的基础。我们的发现也可作为啮齿动物fMRI与药物遗传学以及光遗传学控制操作相结合的基础，以剖析选定细胞群在子网络中的作用，从而能够解析健康和患病脑中大规模网络中发生的细胞特异性机制。这些方法可能会给健康大脑的组织和大脑疾病背后的特定神经元改变带来新的曙光。
