RNAi疗法「图鉴」
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是抵御外源基因入侵的一种天然防御机制。包括小干扰RNA (siRNA)和microRNA (miRNA)在内的RNAi形式能够以一种序列特异性的方式、通过介导靶mRNA降解或抑制mRNA翻译来敲低靶基因的表达。由于siRNA和miRNA之间的细微差异（一个miRNA可能同时影响几个不同靶基因的表达），siRNA通常能够比miRNA触发更有效、更具特异性的基因沉默，因此，siRNA和miRNA在药物实践中有着不同的作用（图1）。
自1998年RNAi概念确立以来[1]，siRNA疗法经历了多次起起落落。2001年，Sayda M.Elbashir等通过将化学合成的siRNA引入哺乳动物细胞，成功地沉默了一个特定基因的表达[2]。这一突破进展导致了一波研发热潮，到2003年，已有很多家公司布局RNAi疗法。
不幸的是，第一次使用未经修饰的siRNA进行的临床试验产生了与免疫相关的毒性，以及可疑（不确定）的RNAi效应。第二波临床试验使用了系统给药的siRNA纳米颗粒制剂，尽管取得了重要进展（如，首次证实siRNA纳米颗粒系统给药可在人体内产生RNAi效应），但依然表现出了显著的剂量限制毒性以及疗效不足。这些研发中暴露的问题使得大部分制药公司在2010年代早期退出了RNAi领域。
不过，随着科学家们在化学修饰以及递送方面不断取得新的突破，RNAi疗法逐渐又回到药物研发的“中心”。2018年，该领域迎来了一个里程碑：美国FDA批准了首个RNAi疗法（ONPATTRO®）上市，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的神经损伤。2019年11月，FDA又批准第二款RNAi疗法GIVLAARI™用于治疗急性肝性卟啉症（acute hepatic porphyria, AHP）。
与小分子和单克隆抗体药物相比，siRNA具有先天优势，因为siRNA通过与mRNA完成Watson–Crick碱基配对来实现其功能，而小分子和单克隆抗体药物则需要识别某些蛋白质复杂的空间构象。有许多疾病无法通过小分子和单克隆抗体药物治疗，因为，无法鉴定出针对致病蛋白的具有较高活性、亲和力和特异性的分子。相反，从理论上讲，siRNA可以靶向任何感兴趣的基因，只需要选择靶向mRNA上正确的核苷酸序列。这一优势使得siRNA比小分子或抗体药物的研发周期更短，治疗领域更广。
不过，尽管siRNA在药物开发方面有着广阔的前景，但细胞内和细胞外的多重障碍限制了其广泛的临床应用。比如，未经修饰的siRNA具有稳定性不理想、药代动力学特征较差、可能诱导脱靶效应等缺点。此外，siRNA的磷酸二酯键易受RNases和磷酸酶的损伤。一旦通过系统给药进入循环，遍布全身的内切酶或外切酶将迅速将siRNA降解为片段，阻止了完整的治疗用siRNA在预期组织中积累。
另一方面，理论上，siRNA只有在其反义链与目标mRNA完全碱基配对时才能发挥作用。然而，RNA诱导的沉默复合物(RISC)可以耐受少数不匹配的基因，这可能会导致少数核苷酸不匹配的基因发生不期望的沉默。此外，siRNA的有义链也可能下调其他无关基因的表达。最后，未经修饰的siRNA还可能会导致Toll样受体3 (TLR3)的激活，并对血液和淋巴系统产生不利影响。这些发现引发了对siRNA安全性和成药性的大量担忧。
为了最大限度地提高治疗效果、减少或避免siRNA的副作用，研究人员在调查各种化学修饰模式和开发多种不同的给药系统方面做了大量努力。一系列修饰模式对siRNA疗法的活性、稳定性、特异性和生物安全性的影响已在临床前和临床中接受评估。基于脂质、类脂材料(lipidoids)、聚合物、多肽、外泌体、无机纳米颗粒等的递送材料也已经在被调查研究中。
6月19日，来自国家纳米科学中心、广西医科大学以及北京理工大学的几位研究者在Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy 杂志上最新发表了一篇题为“Therapeutic siRNA: state ofthe art”的综述，对siRNA的修饰和传递技术的详细发展进行了讨论[3]。同时，这篇文章也提供了siRNA疗法发展的一个历史回顾。
以下参考文中图表，摘编部分要点内容：
一、siRNA修饰
如前文所述，在siRNA疗法发展的早期阶段，许多药物的设计是基于完全未经修饰或轻微修饰的siRNA，以到达适当的组织，然后沉默靶基因。这些分子能够在体内介导基因沉默，特别是在接受局部药物治疗的组织中，例如眼睛。然而，使用这些完全未经修饰或轻微修饰的siRNA不仅可能疗效有限，还会存在潜在的脱靶效应。例如，Kleinman及其同事观察到，被开发用于治疗年龄相关性黄斑变性的siRNA疗法bevasiranib（靶向VEGFA）和AGN211745（靶向VEGFR1）触发了TLR3及其适配器分子TRIF的显著激活，诱导了白细胞介素-12和干扰素-γ的分泌。
化学修饰siRNAs，如以2′-O-methyl(2′-OMe)或2′-methoxyethyl (2′-MOE)基团取代2′-OH的siRNA、以锁核酸（locked nucleic acid, LNA）和非锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)或乙二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA) 取代某些核苷酸的siRNA，能够有效地抑制免疫刺激性siRNA驱动的先天免疫激活，提高活性和特异性，减少脱靶诱导的毒性（图2）。
为了提高siRNA的效力和降低其潜在毒性，科学家们已经开发并测试了大量的化学修饰模式。根据在核苷酸中的修饰位点，用于siRNA的化学修饰和类似物的结构可分为三大类：1）膦酸修饰；2）核糖修饰；3）碱基修饰，在图2中分别用红色、紫色和蓝色表示。通常，这些修饰被同时引入siRNA中。例如，ONPATTRO®同时使用了2′-OMe和 2′-deoxy-2′-fluoro (2′-F)修饰；QPI-1007的反义链进行了2 2′-OMe修饰，正义链中使用了一个“inverted deoxyabasic moiety”和一个L-DNA胞苷核苷酸进行修饰；inclisiran (ALN-PCSsc)同时用phosphorothioate(PS)、2′-OMe、2′-F和2′-deoxy进行了修饰（图3）。
图3 siRNA化学修饰的代表性设计，包括了ONPATTRO®、QPI-1007、GIVLAARI™和inclisiran的序列和修饰细节。(来源：Signal Transduction and Targeted Therapy )
二、siRNA递送
系统给药外源性siRNA需要绕过一系列障碍才能实现基因沉默，如核酸酶降解、短暂的循环、血液循环中的免疫识别、在目标组织中的积累、有效的跨膜运输以及从内体和溶酶体逃逸到细胞质中。通过加入化学修饰，核酸酶降解和免疫识别方面的挑战已经得到了很好的解决，但一些其它障碍仍需克服。
在血液循环中，非特异性结合和肾小球滤过都会阻碍siRNA在目标组织中的积累。负载siRNA的纳米制剂的中性表面电荷有利于避免在循环中不利结合的发生。而配体- siRNA偶联物能够通过配体（如碳水化合物、肽、抗体、适配体、小分子等）与表面受体之间的特异性识别和相互作用将siRNA转运到所需的组织和细胞中。这种主动靶向策略不仅可以减少siRNA在非预期组织中的积累，从而降低或避免不良副作用和毒性，还能够在低剂量下实现有效的基因沉默。
siRNA长约7-8 nm，直径约2-3 nm。这种分子太大，不能穿过细胞膜，但又小到可以被肾小球自由清除。因此，一旦siRNAs离开血液，它们就会在膀胱中积累，并在几分钟到半小时内迅速从体内排出，这就阻止了它们在目标组织或细胞中积累。将siRNA包封在囊泡中或将其与特定配体偶联，能够有效避免肾脏的清除，更重要的是，可以将siRNA递送到所需的组织或细胞。脂质纳米颗粒(LNPs)、dynamic polyconjugates (DPC™)和GalNAc–siRNA偶联物都能有效地将siRNA递送至肝细胞(图4、图5)
由于相对较高的分子量(~13-16 kD)和净负电荷会阻止人工siRNA穿过细胞膜。因此，研究人员试图确定是否有细胞可以在没有载体的情况下内化siRNA。研究得出的结论是：裸siRNA（naked siRNA）只能被少数细胞吸收，如视网膜神经节细胞(RGCs)和神经元。此外，研究人员还致力于鉴定各种载体，以实现高效的跨膜传递。阳离子细胞穿透肽(CPPs)成为了早期研究的首选。CPPs的尾部通常带有富含精氨酸的序列，能够通过胍盐基团与细胞表面的负磷酸盐、硫酸盐和羧酸盐相互作用形成双齿键。这种相互作用会导致膜孔形成，使得细胞吸收siRNA。实现跨膜运输的另一个策略是，用带正电荷的脂质或聚合物中和siRNA的负电荷，使siRNA更容易结合到膜上，以及更容易通过吸附胞饮作用内化。
最后一步，siRNAs必须有效地从内体和溶酶体逃到细胞质中。大多数非病毒类载体主要通过内吞途径进入细胞，内吞后的载体会与生物膜成分组装成内体，之后通过多种机制发展为溶酶体，而溶酶体中有大量的降解酶，会使其包含的基因药物发生降解而失效，因此，一种有效的非病毒载体应能够促进基因药物快速从内体中逃离。许多递送系统使用一个pH敏感单元来响应内体和溶酶体的pH变化，在那里它们将吸收H+，在表面呈现一个正电荷。然后，内体或溶酶体的渗透压会增加，导致Cl-和H2O在内部流动。最后，这些变化可能导致膜破裂、siRNA被释放到细胞质中。然而，内体释放的潜在机制仍有待进一步阐明。因为只有1%-2%内化的LNP-loaded siRNAs可被释放到细胞质中，而且这只发生在内化后的有限时间内。因此，进一步理解siRNA的逃逸机制以及如何提高逃逸效率对siRNA药物的开发具有重要意义。最近有研究报道了新型内质网膜修饰的hybrid nanoplexes (EhCv/siRNA NPs)。与未修饰的nanoplexes相比，内质网膜修饰的hybrid nanoplexes在体内和体外都显示出更高的RNAi活性。内质网膜上的功能蛋白在siRNA的胞内转运中发挥了重要作用，可帮助siRNA通过内体-高尔基- ER途径（而不是内体-溶酶体途径）到达细胞质，从而避免了siRNA的溶酶体降解。此外，电穿孔可使siRNA能够直接穿过细胞膜，这也是规避内体逃逸问题的有效途径。
三、siRNA疗法的临床开发
如前文所述，到目前为止，有两种RNAi疗法——ONPATTRO®和GIVLAARI™——已获批上市。另有两种siRNA——lumasiran(ALN-GO1)和inclisiran已向FDA提交新药申请(NDA)。7个siRNAs正在进行III期临床研究，更多的候选siRNAs仍处于早期开发阶段。下表总结了部分RNAi疗法的临床和临床前活性。
表1 部分RNAi疗法的临床和临床前活性
（点击查看大图）
如图6所示，按目标组织来看，肝、肿瘤、皮肤、血液、眼、肾等组织均有靶向它们的siRNA和miRNA正处于临床开发阶段。其中，靶向肝脏的项目最为丰富，其次是肿瘤、皮肤。
四、总结与展望
由于siRNA作用机制的独特性，这类分子能够用来靶向几乎所有疾病相关的兴趣基因。siRNA疗法的研发时间也比小分子、单克隆抗体和蛋白质短得多。随着用于罕见疾病治疗的ONPATTRO®和GIVLAARI™成功商业化，siRNA疗法很快将在治疗常见疾病(如血脂异常)方面取得另一个里程碑，因为inclisiran的几项III期临床研究均显示出了优秀的数据。
得益于对修饰模式和递送系统的长期探索，siRNA疗法的有效剂量已经从数毫克（milligrams）降低到了10−3毫克，半衰期已经从分钟级（minutes）延长到了数月。携带复杂化学修饰的GalNAc–siRNA偶联物使siRNA疗法每季度一次或一年两次皮下给药成为了可能，这是医药史上从未实现的伟大成就。
在开发了用于siRNA肝脏递送的GalNAc–siRNA偶联物后，科学家们也在致力于开发肝外递送平台。目前，在向肾、中枢神经系统和眼部靶向递送siRNA方面已经取得了一些重要进展。该综述的作者们认为，不断升级的siRNA技术必将改变我们未来的生活。
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