从染色体数目异常到癌症：是什么引起免疫系统失灵？
所有的体细胞都有一定数量的染色体，比如人类细胞就有23对。在细胞分裂时，该染色体的数目可能存在增加或减少的情况，而这通常对生物体危害极大。
MIT生物学家首次发现了免疫系统清除这些基因异常细胞的机制。大多数细胞在染色体数量异常之后，会立马向免疫细胞发出信号，这些自然杀手会就将此异常细胞清除。
图丨染色体分离错误会导致异常的染色体组型，此时的染色体会发生非整倍性改变。照片中正在分裂的细胞正在经历一次异常的染色体分离过程。
该发现为免疫系统自动清除癌细胞的机制提供了可能性，因为很多癌细胞的染色体数目是异常的。
“如果我们重新激活免疫系统的识别机制，就有可能引导其清除癌细胞，”论文的作者之一，MIT生物系教授Angelika Amon表示。
该研究于6月19日发表在Developmental Cell上，论文的第一作者是科赫研究所的科学家Stefano Santaguida。
恶性循环
图丨正常人类的染色体类型和数目
在细胞分裂之前，其染色体数会翻倍并在细胞中间排成一排。当分裂开始时，一半的染色体会被拉到左边，而另一半会被拉到右边，进而在两边分化成两个子细胞。如果这些染色体分离时产生错误，两个子细胞的染色体数量就会异常——这被称为非整倍性改变。
当非整倍性改变发生在胚胎细胞时，就会对整个机体产生致命影响。对于人类来说，多一条21号染色体会导致唐氏综合征，而13号和18号染色体的增加会导致更加严重的帕陶综合征和爱德华氏综合征，如果X和Y染色体异常则会导致非致命性的一系列畸形。
图丨染色体异常疾病的各种症状
在近几年里，Amon的实验室正在研究关于非整倍性改变的一系列问题。当正常成人的细胞发生非整倍性改变时，该细胞存活和繁衍的机会应该会大大减小，然而同样发生了非整倍性改变的癌细胞却能疯狂增长。
“非整倍性改变对大多数细胞来说是致命的，但却与细胞数量疯长的癌症高度相关。所以问题在于：如果非整倍性改变损害细胞的繁衍，那么为什么主要的肿瘤细胞都是非整倍性的？”Santaguida表示。
为了回答这个问题，研究者必须找出非整倍性改变具体是如何影响细胞的。在过去的几年内，Santaguida和Amon研究在染色体分裂错误发生后的瞬间到底发生了什么，才导致子细胞的畸形。
图丨癌细胞的发展过程
研究团队人为干扰了正确分裂过程中染色体和纺锤丝的接触过程（纺锤丝在该步骤中对染色体起固定作用），这导致部分染色体在分离过程中落后，然后被随机分配到其中一个子细胞中。
研究者在创造了第一批染色体数目异常的细胞之后，马上开始了下一轮的细胞分裂，并导致了更多的染色体异常和严重的DNA损害。最终，所有细胞都停止了分裂。
“从基因异常发生开始，这些细胞就处于一个恶性循环之中。”Amon表示。
靶向非整倍性改变
随着基因错误的积累，非整倍染色体的细胞渐渐变得不稳定，并开始不断分裂。在这一阶段，它们开始引发发炎现象，制造出包括细胞因子在内的活性分子。当这些异常细胞遇到免疫细胞时，自然杀伤细胞破坏了大部分的非整倍性细胞
图丨癌细胞
在未来的研究中，研究人员希望更准确地确定非整倍性体细胞吸引自然杀伤细胞的机制，并找出是否有其他免疫细胞参与了非整倍性体细胞的消灭过程。另外，肿瘤细胞如何逃过免疫细胞的攻击，以及这一过程是否会在癌症病人体内再次出现，这些也是有待探索的。
“我们第一次见证了一个可能造成染色体数目异常的细胞机制。”Santaguida认为。
“在某一个时间点上，染色体数目高度异常的癌细胞会从免疫系统的围剿中逃出。”Amon说，“而且我们还没有发现它们具体如何逃出去了。如果我们可以找到这一机制，就可能为癌症的治疗提供突破性的进展。”
来源：https://www.sciencedaily.com/releases/2017/06/170620093229.htm
（来源：DeepTech深科技 2017-06-21 ）
【扩展阅读】
肿瘤进化中的染色体异常
不破不立，癌症与染色体异常
异常染色体致癌论
癌症病因的最新讨论 彼得·迪斯贝格(Peter Duesberg) 一个世纪前,两位德国科学家发现,染色体紊乱可能是癌症的直接成因,但这一发现没有得到应有的关注,因为科学界的主流观点认为,基因突变才是引起癌症的真正原因,染色体紊乱只是癌症发生的结果。随着检测技术的进步,越来越多的发现和证据与主流理论背道而驰,科学 家不得不重新审视100年前的那个发现:难道染色体紊乱真是癌症的成因而非结果? 撰文 彼得·迪斯贝格(Peter Duesberg) 翻译 胡晨 审校 李锦军 20世纪60年代初,作为一名博士后研究人员,我开始研究癌症。当时,很多著名科学家都认为,病毒是引发绝大多数肿瘤的罪魁祸首。因为科学家们发现,一些病毒感染细胞后,会将自身的遗传物质插入细胞的基因组,引起细胞的恶性转化和异常增殖,最终导致白血病等癌症。那时候,我乐观得近乎于天真,以为只要弄清楚了病毒诱发癌症的分子机制,就能研制出相应 疫苗,彻底消灭癌症。 在这场抗击癌症的战役中,我也做出了不小的贡献。1970年,我和赖明诏 (Michael Lai)、彼得·沃格特(Peter Vogt)合作,从鸟类劳氏肉瘤病毒(avian Rous sarcoma virus)中分离出了一个特殊的基因——src,它很可能就是引发肿瘤的真凶。几年之后,一些科学家有了进一步的发现,在动物(包括人类)的DNA中,竟然存在一个与src极其类似的基因!一个新的癌症理论模型诞生了:如果受到外界刺激,人类基因组里的src基因发生了突变,它就会像病毒基因一样,拥有强大的致癌能力。具有潜在致癌能力的基因就像一颗颗“定时炸弹”,埋藏在 人类基因组里,随时可能爆发。它们为自己赢得了一个响亮的名号——“原癌基因” (proto-oncogene),一旦发生突变,原癌基因就会变成癌基因。
过去30年,“关键基因的突变是所有癌症根源”的论调一直统治着学术界,科学界形成了这样一个观点:只需要几个癌基因,就能使正常细胞转化为癌细胞。但是,包括我在内的很多科学家,花费了30年的时间,都没能找到支持上述观点的证据。由于深受癌基因模型的影响,科学家只见树木,不见森林:在所有已知的肿瘤中,某些基因的确发生了突变,然而承载着数千个基因的染色体同样伤痕累累——复制失常、屡屡断裂、结构重排甚至整体缺失。越来越多的证据显示,染色体的混乱状态并非恶性转化的副作用,而是癌症发生的直接原因和推动 力,这与主流观点截然不同。 与美国、欧洲的同事一起,我们花了10多年时间探索染色体混乱与癌症的关系。近年来,我们得到的支持越来越多,不少研究人员经过研究,也得出了相似结论:染色体数目与结构的改变足以引发某种癌症,而单个基因的突变则没有如此强大的力量。这一理论为癌症的预防、治疗以及前期诊断指明了新方向。而且,癌细胞和肿瘤表现出的某些特性是癌基因模型无法 解释的,但“染色体理论”却能作出比较合理的解释。 谁导致了癌症? 每条染色体都是数千个基因的载体,染色体一旦发生改变,就会引发连锁效应:基因数量改变, 蛋白质的合成受到影响,细胞机能紊乱,接着转变成恶性细胞,癌症随即发生„„ 为什么我们会提出癌症的染色体理论?部分原因在于,我们一直在思考这样的问题:一个正常的人类细胞为什么是“正常的”,为什么会是“人类的”,到底是哪些生物学特征赋予细胞这样的自然属性?对于染色体,自然界是极端保守的,不会轻易改动。染色体是一部完整的生命百科全书,每个物种都有一套独特的染色体(即染色体组),对于物种的存在,染色体具有决定性作用,而且它会始终保持稳定。有性生殖迫使物种的染色体组具有很强的保守性,因为胚胎的发育依赖于染色体的绝对一致性——如果染色体变异,或错误配对,细胞几乎只能选择死亡。不过,凡事都有例外,唐氏综合征(Down syndrome)就是一个罕见例子。患有这种疾病的病人,仅仅因为细胞内多了一条很小的21号染色体,就不得不承受先天弱智的痛苦。
相对而言,在动物体内,单个基因经常发生变异,例如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs),大部分是DNA序列上单个核苷酸发生的有益突变,这种突变散布在每 个人的基因组上,还可以遗传给后代。 癌细胞和正在癌变的细胞都会违背“染色体组稳定”这一自然法则。正常的人类细胞都是二倍体,因为它们都携带了两套人类所特有的染色体,而癌细胞都是非整倍体的(也就是说癌细胞内的染色体套数不能被1整除),这就是说它们要么多了几条或几段染色体,要么缺失了一些。由于是非整倍体细胞,癌细胞内的DNA总量有可能比正常二倍体细胞多一倍或者少一半。在这种情况下,细胞内各种蛋白质的含量将大幅改变,因为编码蛋白质的基因数量会随着染色体的改变而改变:染色体增多,基因数量也增多,反之亦然。在细胞内,各种类型的酶蛋白相互配合,共同完成着一些重要工作,比如修复DNA、清除受损DNA。蛋白质数量的严重失衡,将不可避免地扰乱原本协调的工作环境。这样一来,细胞的内在结构和调控系统就变得不稳定了。纺锤体(spindle apparatus)是细胞内最复杂、协调最精细的蛋白团队,同时它又最脆弱。在细胞有丝分裂的过程中,纺锤体的作用是隔开染色体,但非整倍体一旦形成,纺锤体就 无法处理多出来的染色体,染色体组就会更加紊乱。 这也可以解释为何在同一肿瘤中,不同细胞会有不同的染色体组合与变异,每个细胞都变得与众不同。因为本身的不稳定性,肿瘤细胞拥有了更多的自由空间,能够演化出新的特征和行为方式,而不像正常细胞,只能遵从自然规律,按照预先设定的程序,逐步发育出与所属器官或组织相适应的特征。由于拥有了突变的“特权”,非整倍体细胞变得“桀骜不驯”,开始推卸作为一个细胞应该承担的职责,甚至以牺牲其他正常细胞为代价,大量增殖,独霸一方。 总的来说,癌细胞会变得越来越邪恶。在癌变的过程中,细胞的大小、形状、代谢方式和生长速度都变得极为异常。癌症至今仍然是绝症,主要原因就是癌细胞具有极强的变异能力和变化多端的表型。例如,抗癌药物刚刚消灭了一批癌细胞,具有耐药性的变异细胞会立即填补空缺。用单种药物对付复杂的癌细胞群体,就等于想用一种药物包治百病;另外一个原因,则是癌细胞具有侵袭周围组织和扩散到全身的“超能力”——也就是医学中的“转移”。 在每一种癌症中,所有恶性细胞其实都来源于同一个病变的母细胞。在某个肿瘤的绝大多数细胞中,染色体异常的方式非常一致,说明这些细胞有一个共同的来源,科学家由此提出了肿瘤的克隆起源学说。但正常的细胞为什么会发生变异,它的表型和染色体为什么会变得不稳 定,以至于引发致命的肿瘤?科学家需要找到一种理论解释这个问题。 直到50年前,大多数科学家还认为,异常染色体引发了癌症。这一观点能得到认可,要归功于两位德国科学家。19世纪末20世纪初,戴维·冯汉泽曼(David von Hansemann)和特奥多尔·博韦里·冯汉泽曼(Theodor Boveri Von Hansemann)在柏林研究癌症时,发现所有癌细胞都含有异常染色体。仔细观察了海胆胚胎的发育过程后,博韦里推测,染色体是遗传信息的承载体。因为他发现,在细胞分裂时,如果某些环节出错,导致染色体损伤,或者染色体不能平均分配到两个子代细胞中,细胞就会恶化。博韦里将这样的畸形胚胎比作肿瘤,1914年,他就预言: 某些染色体数量的增加或减少会导致癌症。 但这一理论被冷落了半个世纪之久。因为以当时的技术条件,无法在癌细胞中检测到染色体混乱的现象。由于没有观察到染色体改变的一致性,染色体混乱被解释为细胞恶变的结果, 是由一种未知因素造成的。 长期以来,一些总被忽略的证据不断提醒科学家,非整倍性在癌症发生和恶化过程中发挥着重要作用。实际上,细胞的非整倍化程度还可作为评价指标,当医生从人体组织提取一些异常细胞,评估它们的恶化几率时,就需要检测染色体的非整倍化程度。一旦细胞异常增殖的产物 被界定为肿瘤或赘生物时但这一理论被冷落了半个世纪之久。因为以当时的技术条件,无法在癌细胞中检测到染色体混乱的现象。由于没有观察到染色体改变的一致性,染色体混乱被解释为细胞恶变的结果, 是由一种未知因素造成的。 高度非整倍化就是细胞恶化的象征。
生物技术日新月异,拥有了先进技术的科学家也开始重新思考几十年前的老问题:能否在癌细胞内检测到特异染色体的改变?很多研究人员迫不及待地展开了研究。甚至连癌基因理论的坚定支持者,在研究肿瘤的非整倍体现象时,也发现染色体改变是恶性肿瘤的驱动力,而某些基因突变则没有这样的作用。染色体一旦发生改变,似乎就能创造出无数具有新表型的癌细胞,这一现象与过去10年得到的实验数据,激起了我和同事们的强烈兴趣,癌细胞为什么会如此不稳定性,造成染色体混乱的原因又是什么,这些问题的答案,将会让我们真正了解染 色体理论。
由果溯因 是什么原因造成了染色体的混乱状态?
科学家研究了很多癌症患者的癌细胞,发现染色体的改变有一个共同的特点:染色体的数量要么有增加,要么有减少。这就说明,染色体数量的改 变可能就是问题的答案。 我们的研究策略是,收集和分析与基因突变理论最不相符的癌变特点,也就是查看现行理论无法解释的特殊案例,希望能找到更完善的理论法则。
我们最终发现,只用基因突变理论无法 阐释的癌症特征有6种,但可以用染色体理论解释。
年龄越大,患癌症的几率越高。在世界范围内,平均每3人,就有一人遭受癌症的折磨,不过患者一般都超过50岁。其实,癌症基本上是一种老年性疾病,一旦超过50岁,我们患癌症的几率就会骤然上升。然而,解释癌症起源的基因突变理论,却预测癌症应该在新生儿中更为普遍。按照这一理论,大约6个关键基因的突变就能导致癌症,因此很多婴儿可能一生下来就患有癌症。假设有6个与结肠癌相关的突变基因,婴儿可能从母亲那里继承了3个,从父亲那里遗传了另外两个,这样就很有可能患上结肠癌,因为在亿万个结肠细胞中,某些细胞随时可能获得第6个突变基因,甚至还有婴儿生来就从父母那里遗传了6个癌基因。然而,结肠癌很少发生在儿童身上。即使通过基因工程的方法,刻意让小鼠从出生时就带上一组致癌突变,它们 患癌风险也不比正常小鼠高。
不过,癌症也有可能发生在小孩身上,尽管几率很小。比如唐氏综合征和遗传性染色体不稳定综合征(镶嵌斑非整倍性综合症,MVA)患者。MVA儿童也有严重的智障,他们体内的细胞进行有丝分裂时,纺锤体上的缺陷就会导致非整倍体细胞的产生,随机分布在身体内,1/3的孩子 会因此患上白血病或其他癌症。 如果某人生来就是非整倍体,或有发展成非整倍体的倾向,癌症很可能会提前发生。
100年前,博韦里观察到非整倍体胚胎无法存活,最主要的原因可能是非整倍体细胞固有的不稳定性, 这可能也是新生儿一般不会患癌症以及癌症不具有遗传性的原因。
致癌物需要很长时间才能导致癌症。
对动物而言,很多化学药品和放射线都是致癌的,它们被认定为职业性或偶发性肿瘤的致病原因。但即使与最强的致癌剂为伍,可能也要在数年甚至数十年之后才会患上癌症。相反,当某种化学物质作用于细菌时,几小时后,细菌的表型就会出现变化;在更大更高级的果蝇中,这种效应也会在几天内出现。致癌物质使细胞癌变的过程, 是逐渐进行的,而这种现象是基因突变模式无法解释的。 不管能否诱发突变,致癌物质都能导致非整倍体的产生。科学家观察了致癌剂对细胞遗传物质的即时效应,期望能找到许多关键基因的突变,结果却出乎意料:许多强力致癌剂根本没有诱发突变。他们使用过的致癌剂包括石棉、焦油、芳香烃、镍、砷、铅、塑料、某些染料、尿烷(urethane)和地高辛(dioxin)等。而且,这些致癌剂引发癌症只需要诱发突变所需剂量的千分之一。在所有实验中,有一个非常重要的现象:经过致癌剂处理后,细胞的染色体变得 非常不稳定,断裂和损坏的发生率远高于正常情况。 上述结果说明,致癌剂的实际作用是导致非整倍化,而不是导致基因突变。一开始,突变致癌理论就无法解释,不导致突变的物质为何也能诱发肿瘤。实际上,导致突变的物质诱发肿瘤,也是通过直接破坏和分割染色体的方式。(例如,辐射导致突变是通过一种间接的方式:先使DNA双链断裂,细胞内的修复蛋白就会开始修复损伤DNA,在这一过程中,核苷酸序列可能发生重排,或在断裂位置引入错误的核苷酸。)芳香烃这类不导致突变的致癌物质,则是通过一种不同的机制诱导非整倍体的产生。芳香烃类物质可以破坏细胞内的微管结构,而在有丝分裂过程中,微管是分配染色体所必需的“工具”。所有致癌物质似乎有一个共同点:随机产生 非整倍体。 在不同的肿瘤中,都存在非整倍体形式。如果非整倍体只是癌症的副作用,那么在不同患者的肿瘤中,染色体改变的方式应该是随机的。
利用两种染色体涂染技术(chromosome-painting technologies)——比较基因组杂交(comparative genomic hybridization)和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization)技术,科学家开始在混乱的癌细胞染色体中寻找可识别的特征。
在这些技术的帮助下,科学家们可以用带有颜色或荧光的DNA来标记、追踪染色 体的微小区域,这样就能描绘出某个细胞中染色体片段扩增、缺失或重排的图片。 研究人员发现,非整倍体也有“非随机”情况。在同一种肿瘤中,癌细胞染色体的改变方式都是一致的,大多数肿瘤(如乳腺癌、肺癌)都有这样的现象,和早先的染色体理论所预言的一样。2006年,瑞典卡罗琳斯卡大学医院的科学家发现,在10名伯基特(Burkitt)淋巴瘤患者的细胞中,3号、13号和17号染色体经常相互交换片段, 7号和20号染色体也经常特异性 地获得或丢失某些片段。 染色体的改变方式只与长出肿瘤的组织有关,而与患者没有太大的关系。这就是说,某一组织的细胞要发生癌变,染色体必须发生一定的改变,才能使细胞摆脱遗传程序的束缚。因此,非 整倍体细胞要走上恶变之路,染色体变异就是最基本的条件。 除了可以判断癌症类型,观察染色体的改变还可以判断癌症的病情、癌细胞的转移能力以及耐药性。例如,卡罗琳斯卡的研究小组指出,17号染色体一个片段的转移,以及7号和20号
染色体上一个片段的增加就与癌细胞的耐药性有关。
染色体的改变如何导致癌症?对癌基因的转录产物和癌细胞内的蛋白质进行分析后,科学家发现,癌基因与正常基因合成蛋白质的水平其实很接近。最近,一个由美国和以色列科学家组成的团队宣布,他们测定了结肠癌细胞中各种蛋白质的含量,发现其中确实有很多蛋白质的合成量过高或者过低,而这种变化与细胞内DNA总量的变化有关。随着细胞非整倍体程度的加重,各种蛋白质的数量差异也变大,肿瘤的恶性程度越加严重。这一结果说明:染色体的非 整倍化使数千个基因的数量增多或减少,进而使细胞产生恶性表型。 不必要的特征无助于肿瘤的存活。有时,肿瘤的一些最常见、最恐怖的特征,并不能提升肿瘤细胞的生存能力。比如,在癌细胞转移之前或在转移过程中,它们本身就具有的、针对从未遇到过的药物的耐药性,并不能帮助它们在与正常细胞的竞争中取得优势。只有那些能够提升癌细胞竞争优势的基因突变,才会被保留下来,所以一个没有经过药物治疗的肿瘤,要通过随机突变的方式来获得耐药基因的几率实际上为零。与单个基因相比,染色体要庞大得多,并携带了数千个基因。由于对癌细胞的特异表型有着重要贡献,染色体会被选择性地保留,很多未被选择的特征也随着染色体一起保留下来。事实上,来自与耐药和转移性相关的染色体变异 的证据,也支持这种可能性。概括地说,癌细胞总是能快速进化出各种所需的表型。 癌细胞变异比基因突变更快,它能很快完成新旧表型的更替。在正常的突变频率下(很多研究显示,在超过90%的肿瘤中,基因突变的速度并没有加快),基因突变的速度与癌细胞产生新 表型的速度相差甚远。 染色体的大规模改变似乎可以加速细胞的变异。为了验证这一观点,我们提取了乳腺癌与结肠癌患者的高度非整倍体细胞,检测细胞中染色体变化的速度,同时观察了细胞获得耐药性需要的时间。这些细胞每分裂100次,染色体就会发生一次变化;每分裂1000～10000次,就会出现一次与耐药性有关的染色体改变。换句话说,在非整倍体细胞中,染色体重新排列和表 型更换的速度,远远超过突变改造基因的速度。 这些实验说明,癌细胞非整倍体程度越高,染色体变异速度越快,也就是说,染色体的不稳定性是由非整倍性造成的。这个恶性循环一旦开始,每个肿瘤细胞都能随机产生自己独有的功能。这个事实可以解释数十年前,英国伦敦皇家癌症医院的莱斯利·福尔茨(Leslie Foulds)观察到的现象:“没有两个肿瘤是完全一样的,即使它们来源于同一块组织„„或者用同样的实验方法诱导生成的。”这种个性化的表现是癌症的另一个特征,而无法用某些基因的激活或 失活来解释,因为特定基因在每个细胞和每个时间段的效应都应该是一致的。 每一个癌变特征都与染色体变异相关,而无法用基因突变理论来完美诠释,我们提出了“修正 版”染色体癌症理论。 致命的循环 染色体发生改变,致使基因和蛋白质数量跟着改变,而基因和蛋白质数量的改变又会导致更 严重的混乱状态„„这是一个致命的循环! 癌症是一种染色体疾病,致癌物质、罕见的遗传病症以及偶发的有丝分裂错误都是通过产生非整倍体引发肿瘤的。非整倍体让数以千计的基因和它们编码的蛋白处于失衡状态,为细胞发展成更严重的非整倍体创造了条件。这种自我加速的循环,成为细胞变异的动力源泉。借用达尔文的经典术语,那就是细胞选择了“自私染色体”组合,最终形成了具有强大生命力和竞争力的新生细胞。(从达尔文进化论的观点来看,只有让细胞的生存力更强的基因才会在进化中被保留下来,“自私基因”一词是理查德·道金斯所创,并作为他的一本著作的书名,所 谓“自私”就是说基因总是倾向于对细胞自身有利。) 一旦癌症开始恶化,染色体的随机重组可以使细胞轻易地获得异常特征,比如耐药性和转移 性等致命特征。因此,用单个药物,甚至针对单个基因的治疗方案很难治愈癌症。
近年来,有些科学家突发奇想,试图用“以毒攻毒”的策略来治疗癌症:损伤细胞的DNA,促进染色体的非整倍体化,让肿瘤细胞不稳定乃至无法存活。
对于较小的局部肿瘤,这种方法或许有效,但 从整体上看,“以毒攻毒”很难操控。 不过,从非整倍体早期发展成恶性肿瘤需要较长的时间,在这段时间,医生可以从容地进行检查和实施外科手术。在癌症早期,还可以通过检查非整倍体来区分恶性肿瘤和“相貌雷同”的良性肿瘤。当癌症进入晚期,检查与耐药或转移性相关的非整倍体,医生就可以选择最适合 的治疗方案。 最后,对食物、药品和环境进行严格筛查,剔除其中可能导致染色体损伤和非整倍体的物质,将非常有益于癌症的预防。今天,我仍然希望研究癌症的科学家重新回到染色体理论这个起 点,真正认清癌症的真面目,为癌症的预防、控制和治疗做出贡献。
（来源：新浪博客/陈钊军论癌症 2013-07-02 ）