9+免疫预后模型真香系列
导语
今天和大家分享的是2020年7月份发表在Briefings in Bioinformatics杂志上的一篇文章“Computational recognition of LncRNA signature of tumor-infiltrating B lymphocytes with potential implications in prognosis and immunotherapy of bladder cancer”(IF=9.101）。文章中作者利用能够识别B细胞特异LncRNA表达模式和TIL-Bs LncRNA验证的TILBLncSig，通过系列的综合免疫、LncRNA和临床分析分析，证明TILBLncSig的作为预测生物标志物的临床结果和患者的免疫治疗响应BCa的潜在作用。
omputational recognition of LncRNA signature of tumor-infiltrating B lymphocytes with potential implications in prognosis and immunotherapy of bladder cancer
一、研究背景
肿瘤微环境(TME)的特征是恶性、非转化细胞(造血源细胞和间充质源细胞)和非细胞成分的混合。肿瘤细胞与TME之间复杂而动态的相互作用对肿瘤的生长、侵袭和转移至关重要。浸润性B淋巴细胞是TILs的重要组成部分，经常出现在TME中，其数量和状态在临床试验和临床实践中被证明是很有希望的结局和免疫治疗应答的参数或指标。膀胱癌(BCa)是最常见的癌症类型之一，2019年美国男性中BCa占所有新病例的7%。根治性膀胱切除术后放疗、化疗和免疫治疗已成为治疗的主要手段，因此需要更准确的分子生物标志物来进行治疗和反应风险预测。长链非编码的表达模式与TME中免疫细胞浸润有关。然而，B细胞特异性的LncRNA及其在评估TIL-Bs、预测临床结果和免疫治疗反应方面的潜在应用，但尚未完全阐明肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIL-B）的LncRNA的功能及其临床意义。
二、研究思路
三、结果解读
1、B细胞特异性预后LncRNA的鉴定
为识别B-cell-specific LncRNAs，我们对B细胞系和其他免疫细胞系进行LncRNA的差异表达分析，发现了141个异常的LncRNA，这些异常的LncRNA在B细胞系中高表达，在其他免疫细胞系中下调，表明了它们对B细胞而不是其他类型的免疫细胞的表达特异性。这141个失调的LncRNA被认为是B cell特异性的LncRNA。随后，对202例Th型BCa患者的生存时间和141个B细胞特异性LncRNA的表达水平进行单因素Cox回归分析，发现数据集24个B细胞特异性LncRNA，它们与生存时间显著相关(P<0.05)。
2、在TCGA RNA-seq数据集中鉴定和评估TILBlncSig预测预后
从24个B细胞特异性LncRNA列表中寻找用于预测预后的最佳LncRNA生物标志物，采用多变量Cox回归模型，对发现数据集中的202例BCa患者的LncRNA表达谱和临床信息进行了分析。最终的标记名为TILBlncSig，由8个B细胞特异性LncRNAs 由 (TNRC6C-AS1, WASIR2, PART1, GUSBP11, MAFG-DT, LINC01184, OGFRP1和AC090515.2) 组成。
表1.TILBlncSig中8个LncRNA的详细信息
将TILBlncSig多变量Cox回归系数加权后的LncRNAs表达值转化为一个风险评分(TILBlncSig评分)，如下图所示：TILBlncSig得分=(-0.2438*TNRC6C-AS1表达量) +(-0.3929* WASIR2表达量) +(0.2234* PART1表达量) +(-0.4645* GUSBP11表达量) +(0.6849* MAFG-DT表达量) + (0.4178* LINC01184表达量) +(-0.3453* OGFRP1表达量) +(-0.3408* AC090515.2表达量)。多因素Cox分析显示，8个LncRNA在TILBlncSig中的预测能力是相互独立的。
计算数据集中每个患者的TILBlncSig评分，并以TILBlncSig的中位数(0.1176)作为风险截止点，将202例患者分层为高风险组(n= 101)或低风险组(n= 101)。低危组患者总生存期(OS)较高危组延长。低危组3、5年生存率分别为89.7、78.9%，显著高于高危组的37.2、31%。TILBlncSig的时变ROC曲线在3年和5年OS时的AUC分别为0.915和0.894。
图1.在TCGA训练和测试数据集中开发和验证TILBlncSig
TILBlncSig的预测能力首次在不重叠的TCGA内部测试数据集中得到验证。TILBlncSig使用相同的评分模型和数据集的风险截止值，将201例患者分为两个OS显著的不同风险组，低危组患者在3年和5年的OS率分别为78.6和75.8%，明显高于高危组(50.6%)。TILBlncSig在3年和5年OS时，时间依赖性ROC曲线的AUCs分别为0.717和0.695。在单变量Cox比例风险回归分析中，风险比(HR)在OS中，高TILBlncSig与低TILBlncSig的比较为2.718，表明TILBlncSig与OS显著相关。
3、TILBlncSig与TIL-Bs相关
为探究TILBlncSig的功能，计算TILBlncSig中8个LncRNA与mRNA的表达相关性，选择前1%的mRNA作为与TILBlncSig共表达的mRNA。KEGG通路富集分析中的mRNA证明了TILBlncSig是高度相关的免疫反应和癌症hallmark-related生物学进展。免疫的免疫渗透水平亚种群在高风险和低风险组患者进一步评估使用single-sample GSEA基于已知的免疫cellspecific标记基因的表达水平。如图2C所示，高危组有11个免疫亚群明显富集，而低危组只有两个免疫亚群富集(CD8 T -cell activated和gamma - delta T -cells)。特别是高危患者组包括B细胞在内的单核免疫细胞浸润水平明显高于其他几种免疫细胞群。在BCa细胞系数据集中进一步的对比分析表明，TILBlncSig的4种LncRNA在BCa细胞系中表达水平明显高于BCa细胞系，表明这些LncRNA在b细胞中的表达特异性高于BCa细胞。这些结果表明，TILBlncSig不仅与患者预后有关，而且也是TIL-Bs的一个指标。
图2.TILBlncSig的功能表征
4、验证TILBlncSig的预后价值
为了评估TILBlncSig的可靠性和通用性，使用几个完全独立的数据集进一步验证了TILBlncSig的预测能力。对于GSE31684数据集中的93例患者，TILBlncSig再次被证明能够区分高、低生存风险的患者。GSE31684数据集分为高危组(n= 39)和低危组(n= 54)，高危组患者预后较低危组患者预后差(P= 0.065;log-rank检验)。在单因素分析中，TILBlncSig也显示与OS密切相关(HR = 1.910, 95% CI, 0.950-3.841, P= 0.069)。
另一个独立的BCa患者数据集(GSE5287)使用Affymetrix HG-U133A平台，其中只有一个LncRNA (PART1)的TILBlncSig被覆盖。因此，GSE5287的30例患者分别被分为PART1高表达组和PART1低表达组(n= 15)。基于LncRNA PART1预测的Kaplan-Meier生存曲线显著不同，但没有达到有统计学意义的水平。
图3.在GSE31684数据集中验证TILBlncSig
在28例GSE38264患者中进一步证实了TILBlncSig，其仅覆盖TILBlncSig的4个LncRNAs (TNRC6C-AS1, PART1, GUSBP11和OGFRP1)。在不重新估计参数的情况下，根据4个LncRNA计算TILBlncSig评分，将患者分为高、低危险组。由于没有任何生存信息，只比较了高危组和低危组LncRNA的表达水平，研究结果与上述观察结果一致。
5、TILBlncSig与临床特征的预测价值
为进一步研究TILBlncSig是否为一个独立的预后因素，对三个BCa患者队列进行了多因素Cox回归分析，包括TILBlncSig和其他常规的临床因素作为协变量。训练数据集和内部测试数据集的结果显示TILBlncSig和分期是独立的预后因素。
图4.TILBlncSig和临床病理因素的预测价值
6、LncRNAs与其他预后模型性能比较
之前的一项分析描述了由LncRNAs、microRNAs和蛋白编码基因(PCG)组成的BCa的转录组特征在预测预后中的作用，因此也比较了TILBlncSig与Liu的研究PCG- LncRNAmicrorna的预后性能。TCGA利用相同的病人数据,AUC TILBlncSig 3和5年的操作系统是0.792和0.771,而相应的3和5年的AUC PCG-LncRNA-microRNA是0.588和0.594。进一步比较Kaplan-Meier生存曲线显示，TILBlncSig预测评分高危的患者预后较预测高危评分的患者差。这些结果表明，TILBlncSig在预测生存方面比PCG-LncRNA-microRNA特征具有更好的预后能力。
7、TILBlncSig作为免疫治疗反应指标的潜力
随后研究了TILBlncSig和免疫检查点基因PD-L1表达水平之间的关系。TILBlncSig与免疫检查点基因显著正相关，免疫检查点基因的表达模式进一步对比了高和低风险组TILBlncSig，分层分析显示,高危患者表现出明显高于免疫检查点基因的表达水平与低风险组，结果与既往研究一致，表明免疫检查点基因参与免疫抑制，其高表达与预后不良相关。为了进一步探讨TILBlncSig与免疫检查点基因之间的交互作用对患者生存的影响，将TILBlncSig与免疫检查点基因的组合将患者分为4组，并对4组患者的生存进行比较。结果显示，TILBlncSig能够区分免疫检查点基因水平相同或相似的患者的结果。此外，未发现免疫检查点基因表达水平与低TILBlncSig患者生存结局之间存在明显关联。而TILBlncSig高表达和免疫检查点基因高表达的患者生存率明显高于TILBlncSig高表达和免疫检查点基因低表达的患者。
图5.TILBlncSig和免疫检查点基因表达对患者生存的影响
这些观察到的TILBlncSig和免疫检查点基因之间的联系，使我们假设TILBlncSig可能是对免疫治疗应答的预测。利用ccRCC免疫治疗数据集中测试TILBlncSig的预测值。采用与发现数据集相同的截止点分层的风险组的Kaplan-Meier曲线如图6A所示。接受抗pd -1单药治疗的高危组和低危组患者的生存率有显著差异。此外，TILBlncSig预测免疫治疗应答的AUC为0.609，这与免疫检查点基因标记物相当(PD-1为0.646,PD-L1为0.625)。更重要的是，当PD-1表达与TILBlncSig结合时，鉴别能力得到提高，AUC从0.646增加到0.719。
图6.TILBlncSig在免疫检查点抑制剂治疗中的意义
四、小结
文章提出了一种基于机器学习的计算框架，即通过对免疫浸润，LncRNA和临床特征的综合分析来鉴TIL-Bs的LncRNA。通过整合免疫浸润、LncRNA和临床分析，探索TILBLncSig作为BCa患者临床结局和免疫治疗反应预测生物标志物的潜力，并揭示了使用PD-1治疗的患者的生存结局和免疫治疗反应的预测价值。